三維生物列印技術概述：成像技術和列印技術
木刻板印刷術的發明和後續15世紀工業化印刷術的發展使得文字和圖像信息可以快速複製和廣泛流傳。可以說，印刷術對世界範圍內的社會、教育、政治、宗教和語言起到革命性的影響。在過去的幾十年內，印刷術已經從二維列印發展到連續層狀疊加的三維列印。由三維(3D)列印而得到的複雜三維結構已經被快速地運用於大規模工業化生產和小範圍的特定結構生產。而且，該技術作為一種理想的產業技術革新，在科學與教育上也擁有很大的指導作用。例如像華生和克里克在模擬DNA結構的時候所使用的球和棒模型，三維列印現在也被運用於複雜的生物細胞組織結構列印，不僅幫助人們認識相關的生物組織，也幫助人們進一步設計和開發新的具有功能意義的生物細胞組織結構。
三維列印於Charlies W. Hull提出。在這個被他成為「立體光刻」技術的中，材料薄層被逐層打出並且被紫外光固化，形成三維結構。這個製備過程後來被運用到用生物材料構成的三維支架的可降解的樹脂模型中。後續發展的無溶劑液體基質的成型系統可以直接在列印三維生物材料所構成的支架中摻雜細胞。然後開發出的生物組織工程的三維生物列印技術則是三維列印技術，細胞生物學與材料科學這3個領域的交叉發展。比如在用三維列印技術構建一個用於臨床的支架和夾板的運用。
在三維生物列印中，通過空間控制各個要素的列印信息逐層精確位置列印生物材料，生物化學物質和活細胞已構成三維結構。實現三維生物列印的方法有很多，包括生物仿生，自組裝和採用微小組織構建單元。研究人員通過發展這些技術來完善列印各種具有功能性的人體組織單元來實現臨床組織和器官功能的恢復。一個重要的挑戰就是如何將溶膠狀的塑料盒金屬轉變為生物相容性優良的生物材料。然而，核心挑戰則是要複製重構出細胞外基質的微觀環境結構以致於各種細胞可以在合適的環境下生長分化來重現生物功能。
筆者將集中討論三維生物列印技術採用到的成像技術和列印技術。現在三維生物列印技術發展出很多具體使用的製備方法，但是主要的核心製備方法還是分為3類，依次為生物仿生、自組裝和微小組織結構單元。但是無論運用什麼方法，都必須將成像技術和列印技術相結合來構件三維列印系統。
一、3種核心製備方法
1.生物仿生
生物工程已被應用於解決許多技術問題，包括飛行、材料研究、細胞培養和納米科學技術。應用三維生物列印涉及製造細胞和細胞外組織的相同複製品。這可以通過複製具有特定細胞功能的組織組件。例如，模擬血管樹的分支模式或製造生理上精確的生物材料類型和梯度。這種方法成功複製生物組織的關鍵在於微尺度的複製。因此，對於微環境的理解，包括功能和支持細胞類型的具體設計，漸變的可溶性或不溶性因素，細胞外基質的合成以及微環境生物內驅作用力都等都是必需的。對這一技術的發展將會對諸多技術領域，包括工程、成像、生物材料、細胞生物學、生物物理學和醫學等各領域的發展起到巨大推動作用。
2.自組裝體系
複製生物組織的另一種方法是使用胚胎器官發展作為參考。組織生長中早期細胞組件誘發相應的細胞外基質組件合成和分泌，並通過適當的細胞信號傳遞，產生自組結構合成和發展，來實現所需的生物微結構和功能模擬。「無支架」技術方法的使用使自組裝細胞胞體進行融合和分裂來模仿自然組織的生成和發展。自組裝體系依賴於細胞在組織生成的內在驅動力，來指導組織生成過程中相關組件的合成、分布、功能實現和結構支持。它需要一個類胚胎組織的發育機制和處理周圍微環境的能力來推動三維生物列印技術在胚胎組織工程的運用。
3.微小組織構件
微小組織構件的概念是與以上2種所描述的三維列印技術息息相關的。器官和組織皆來源於小卻功能完備的組織構件，或者微小組織構件。這些構件可以被定義為組織中最小的結構和功能構件，例如腎元。微小組織構件可以通過合理的設計，自組裝或者這兩者的結合來製造和組裝成更大的器件。主要有2種方法：第一，自組裝細胞胞體（類似於微小組織構件）使用生物仿生設計和合成組裝到一個大規模的組織結構；第二，準確而細緻地複製出一個組織結構單元可以被進一步設計並通過自組裝發展成為有功能宏觀組織結構。這些方法的例子包括血管構建塊中通過自組裝形成支血管來構件血管網路，和通過將三維列印技術和微流體網路技術相結合來構件用於各種藥物和疫苗的篩選和體外疾病模型構件的「器官晶元」的構建。上面這些三維列印方法的組合可以實現列印一個複雜的具有多個功能，結構和機械性能和屬性的生物三維結構。
生物列印過程主要有如下幾個步驟：生物成像和設計，材料選擇和細胞選用，以及相關組織結構的三維列印。在完成三維列印後，所得到的的人造組織可以進行移植，或者在某些情況下，經過一段時間的體外培養再移植，或者用於體外模型分析。
二、成像和數字化設計
要想對一個複雜異構且具有功能的組織和器官進行複製首要要求就是對這個複製組織的自然結構和功能進行充分的認識和理解。醫學成像技術做為一種高效的不可缺少的三維信息獲取技術，可以在細胞，組織和器官各個結構層面提供全方面的信息支持。這些先進的成像技術主要為非侵入式成像技術，包括斷層掃描成像（Computed Tomography， CT），核磁共振成像（magnetic resonance imaging， MRI）。電腦輔助設計和電腦輔助製造（Computer-aided Design and Computer-aided Manufacturing， CAD-CAM）和數學建模也可以用來將斷層分析掃描組織結構的信息數字化。
CT成像，用於診斷和介入分析，是基於不同組織對X射線的吸收程度不同而發展的技術。X射線源在照到物體對象時翻轉，或者穿透照射對象的時候，技術設備中的感測器就會通過測量該變化後的X射線強度和傳播角度，來作為組織信號的一個記錄數據，體現了組織的一個微小結構，即體素。這個成像技術得到每一層的組織結構信息，通過合成和重組，則可以還原三維組織結構。
核磁共振成像具有為軟組織提供空間高解析度且增加對比度解析度的圖像信息的優點，同時可以極大限度地靠近成像組織而不會使目標組織過多地暴露於電離輻射的危害之下。核磁共振成像使用核磁共振：細胞內的生物分子多數都有核自旋現象，在一個強大的磁場中，組織的每一個小部分的核自旋磁場則在外加磁場的作用下重新排列。核能量狀態的變化產生射頻信號，而這一信號則可以被接收線圈測量。在適當使用對比試劑如鋇或CT使用的碘和氧化鐵，以及釓或金屬蛋白可以極大地提高核磁共振掃描成像生物結構的對比度。這些對比增強試劑可以減輕X射線的強度或增強磁共振信號來對高度複雜的結構成像，例如血管，直接的成像很難將它們從周圍的環境中分辨出來。
一旦獲得原始圖像數據，這些成像技術就會通過數據處理並利用層析重建分析來構件二維截面圖像。三維剖析結構圖則是將這些二維截面信息進一步分析或修改。這個過程被稱為「分解剖析」向「合成剖析」的轉變。使用CAD-CAM計算機三維建模和數學模擬技術是被廣泛用來生成三維器官或組織結構的處理方法。三維剖析生成三維生物結構的觀點認為，在同時保留圖像體素的信息用於三維結構展現，描繪和成像是該技術三維圖像的核心價值。重建圖像或模型可以以多種方式來展現，包括輪廓棧、線框模型、陰影模型或固體模型與變數照明、透明度和反射率。
如果目標是要生成一個精確的組織和器官的圖像，那麼二維橫截圖或三維結構圖可以直接運用於生物列印。雖然，直接複製一個病人自己的器官在工業生產中不會很理想（因為疾病和傷殘導致器官的巨大差異）也不會很經濟。但是這些成像技術則可以使這種為病人量體裁衣的精準治療提供可能性。而且，用這些技術創立的模型還可以用來對該組織器官日後再機體內的機械和生物化學性能。目前，CT和MRI數據已經成為再生醫療領域提供數據支持主要實現技術，而這些技術數據也將為生物列印技術提供全方面的幫助。
三、組織生物列印方法
主要沉積和構型的生物材料製備技術包括噴墨，微擠出和激光輔助成型。基於對錶面粗糙度，細胞存活率和可用於列印的生物材料的不同使用條件的要求，這些成型方法各自的優缺點都需要被仔細考慮。
1.噴墨列印
噴墨印表機（也被稱為按需滴定印表機）是在生物樣品和非生物樣品成型時最經常使用的印表機。可控液體體積被輸送到預先設定的列印位置。第1台運用於生物列印的噴墨印表機是基於商業二維墨基印表機的原型進行發展而得到的。在這個印表機中，墨盒中的墨水被可列印的生物材料取代，而紙張則變成可以提供Z軸方向（除了X和Y軸方向的第3維度）控制的電控升降列印平台。現在，墨基生物印表機可以按照不同客戶在解析度，精準度和速度各方面的具體需求處理並列印相關的生物材料。噴墨印表機是利用熱的或聲的驅動作用來將生物材料液滴列印在一個特定的材料基底上。
熱噴墨印表機通過電加熱列印頭以產生迫使墨滴從噴嘴出來的壓力脈衝而起作用。幾個研究已經證明，該局部加熱（其可以在200～300℃的範圍內）對生物分子（例如DNA）的穩定性或對具有功能的哺乳動物細胞的存活率和後期培養不具有實質性影響。已經證明，加熱的短持續時間（～2μs）導致印表機頭中的總體溫度僅升高4～10℃。熱噴墨印表機的優點包括高的列印速度，低成本和廣泛運用範圍。然而，將細胞和材料暴露於熱和機械應力，低液滴方向性，不均勻液滴尺寸，噴嘴頻繁堵塞和不可靠的細胞封裝的風險等這些相當大的缺點使得在3D生物列印中使用這些印表機還不是特別理想。
許多噴墨印表機包含壓電晶體，其在列印頭內部產生聲波，以便以規則的間隔將液體破碎成液滴。向壓電材料施加電壓引起形狀的快速變化，這又產生從噴嘴噴射液滴所需的壓力。其他噴墨印表機使用與超聲場相關聯的聲輻射力從空氣－液體界面噴射液滴。可以調節超聲參數，例如脈衝，持續時間和振幅，以控制液滴的尺寸和噴射速率。聲噴墨印表機的優點包括產生和控制均勻的液滴尺寸和噴射方向性以及避免細胞暴露於熱和壓力應力源。另外，可以通過使用開放池無噴嘴噴射系統來避免施加在噴嘴末端壁處的細胞上的剪切應力。這降低了細胞活力和功能的潛在損失，並避免了噴嘴堵塞的問題。聲學噴射器可以以可調節陣列形式組合成多個噴射器，以便於同時印刷多種電池和材料類型。即使如此，仍然存在一些關於壓電噴墨生物印表機使用的15～25 kHz頻率以及它們誘導細胞膜損傷和溶解的可能性。由於使用較高粘度的溶液噴射液滴所需的過大的力，噴墨生物印表機也對材料粘度（理想地低於10 cP）具有限制。
噴墨生物列印的一個常見缺點是生物材料必須是液體形式以能夠形成液滴;因此，印刷液體必須形成具有結構組織和功能的固體3D結構。這種限制可以通過使用在沉積後可以通過使用化學，pH或紫外線機制的印刷而交聯的材料來解決。然而，交聯的要求通常減慢生物列印過程並涉及天然存在的細胞外基質（ECM）材料的化學改性，這改變了它們的化學和材料性質。另外，一些交聯機制需要對細胞有毒性的產物或條件，其導致降低的活力和功能性。基於噴墨的生物列印技術的用戶遇到的另一個限制是難以實現生物相關的細胞密度。通常，低細胞濃度（少於1 000萬細胞/mL）用於促進液滴形成，避免噴嘴堵塞和降低剪切應力。較高的細胞濃度也可以抑制一些水凝膠交聯機制。
儘管存在這些缺點，基於噴墨的生物印表機還提供了許多優點，包括低成本，高解析度，高速度和與許多生物材料的相容性。噴墨印刷的另一個優點是通過改變液滴密度或尺寸而在整個3D結構中引入細胞，材料或生長因子的濃度梯度的可能性。由於標準2D噴墨印表機的可用性，許多實驗室的研究人員可以讀取，修改和實驗基於3D噴墨的生物列印技術。由於其簡單的部件和容易獲得的設計和控制軟體，商業上可獲得的噴墨生物印表機也是相對成本有效的。該技術由許多團體的廣泛應用加速了噴墨生物印表機精確沉積具有均勻細胞密度的高解析度和精確可控液滴尺寸的能力的進步。液滴尺寸和沉積速率可以電子控制，並且範圍可以為< 1 pL至> 300pL，體積比率為1～10 000液滴/ s。已印刷了單個液滴的圖案，每個液滴包含１～２個細胞，線寬約50μm。未來的進步將繼續適應這種技術，以處理和沉積其他生物相關材料，以便於它們的印刷和提供組織的基本生物，結構和功能組件的方式。還必須解決額外的複雜性，例如對多種細胞類型和材料的需求。
噴墨生物列印方法的顯著實例包括原位功能性皮膚和軟骨的再生。該方法的高印刷速度使得可以將細胞和材料直接沉積到皮膚或軟骨損傷中。這些應用通過生物相容性化學反應或光引發劑實現含細胞材料的快速交聯，並通過將材料暴露於紫外光下進行交聯。噴墨方法促進原代細胞或幹細胞類型的沉積，其在整個病變體積中具有均勻的密度，並且在印刷後維持高細胞活力和功能。這些研究表明基於噴墨的生物列印再生功能結構的潛力。
使用靜電紡絲和噴墨生物列印的組合也在體外製造了層狀軟骨構建體。混合電紡絲—噴墨生物列印技術使得製造支持細胞功能並保持合適的機械和結構性質的層狀構建體的列印成為可能。噴墨生物印表機也已經用於製造骨骼構建體的製備，所構建的骨骼構建體在植入小鼠之前在體外發育到一定階段，然後它們繼續在體內成熟並形成與內源性骨組織具有相似密度的高度礦化的組織。
2.微擠出生物列印
最常見和負擔得起的非生物3D印表機使用微擠出。微擠出生物印表機通常包括溫度控制的材料處理和分配系統和階段，其中1～2個能夠沿著X、Y和Z軸移動，用於照射沉積區域的光纖光源和/或用於光引發劑激活，用於XYZ命令和控制的攝像機，以及壓電加濕器。一些系統使用多個列印頭來促進幾種材料的串列分配，而無需重新裝配。每年在全球銷售近30 000台3D印表機，並且學術機構越來越多地在組織和器官工程研究中購買和應用微擠出技術。工業印表機相當昂貴，但是具有更好的解析度，速度，空間控制能力和在它們可以列印的材料中的更大的靈活性。
微擠出印表機通過機械控制擠出材料來起作用，該材料通過微擠出頭沉積到基底上。微擠出產生連續的材料珠而不是液滴。如CAD-CAM軟體所指導的，在2個維度上沉積小的材料珠，階段或微擠出頭沿著z軸移動，並且沉積層用作下一層的基礎。大量的材料與微型擠出印表機兼容，包括材料如水凝膠，生物相容的共聚物和細胞球體。擠壓用於3D生物列印應用的生物材料的最常見方法是氣動或機械（活塞或螺桿）分配系統。由於氣動系統中的壓縮氣體體積的延遲，機械分配系統可以提供對材料流的更直接的控制。基於螺桿的系統可以提供更多的空間控制，並且認為有利於分配具有較高粘度的水凝膠，儘管氣動系統也可以適合於分配高粘度材料。氣動印表機具有具有更簡單的驅動機構組件的優點，其力僅受系統的空氣壓力能力的限制。機械驅動機構具有更小和更複雜的部件，其提供更大的空間控制，但通常具有降低的最大力能力。
微擠出方法具有非常寬範圍的流體性質，其與該方法相容，具有文獻中描述的廣泛的生物相容性材料。已經顯示粘度範圍為30 mPa /s至> 6×107 mPa /s的材料與微擠出生物印刷機相容，其中較高粘度的材料通常為印刷構造提供結構支撐，而較低粘度材料提供合適的環境維持細胞活力和功能。對於微擠出生物列印，研究人員經常利用可熱交聯和/或具有純粹稀薄特性的材料。幾種生物相容性材料可以在室溫下流動，這允許它們與其他生物組分一起擠出，但在體溫下交聯成穩定的材料。或者，在生理上合適的溫度（35～40℃）下流動但在室溫下交聯的材料也可用於生物列印應用。具有剪切稀化性質的材料通常用於微擠出應用。這種非牛頓材料行為導致響應於剪切速率的增加而降低粘度。在生物製造期間存在於噴嘴處的高剪切速率允許這些材料流過噴嘴，並且在沉積時，剪切速率降低，導致粘度急劇增加。微擠出系統的高解析度允許生物印表機準確地製造使用CAD軟體設計的複雜結構並且促進多種細胞類型的圖案化。
微擠壓生物列印技術的主要優點是能夠沉積非常高的細胞密度。在組織工程器官中實現生理學的細胞密度是生物列印領域的主要目標。一些組已經使用僅包含細胞的溶液以利用微擠出印刷創建3D組織構建體。沉積多細胞細胞球體並允許其自組裝成所需的3D結構。組織球體被認為具有可以複製組織ECM的機械和功能性質的材料性質。根據結構單元的粘彈性性質，並置的細胞聚集體彼此融合，形成粘性宏觀結構。自組裝球體策略的一個優點是潛在地加速組織組織和指導複雜結構形成的能力。這種方法通過在3D生物列印的器官中通過圖案化自組裝血管組織球狀體來顯示在3D厚組織或器官結構中產生器官內支脈管樹的希望。用於無支架組織球體生物列印的最常見的技術是機械微擠出。
微擠壓生物列印後的細胞活力低於基於噴墨的生物列印；細胞存活率在40％～86％的範圍內，隨著擠出壓力的增加和噴嘴規格的增加速率降低。通過微擠出沉積的細胞降低存活力可能源於粘性流體中施加在細胞上的剪切應力。分配壓力可能比噴嘴直徑對細胞活力具有更大的影響。儘管可以使用低壓力和大噴嘴尺寸來維持細胞活力，但缺點可能是解析度和列印速度的主要損失。保持高活力對於實現組織功能是必要的。雖然許多研究報告維持印刷後的細胞活力，研究人員證明這些細胞不僅生存，而且在組織構建中執行其基本功能是重要的。
增加列印解析度和速度對於許多微擠出生物列印技術的用戶是一個挑戰。非生物微擠出印表機能夠在10～50μm/s的線速度下解析度為5μm和200μm。是否這些參數可以使用生物相關材料匹配，同時保持高細胞活力和功能尚待觀察。使用改進的生物相容材料，例如動態交聯的水凝膠，其在印刷期間機械穩定，並且在印刷後形成二次機械性能可能有助於在印刷後維持細胞活力和功能。單相、雙相和連續級配支架也正在使用類似的原則設計。此外，噴嘴、注射器或電機控制系統的改進可以減少列印時間以及允許同時沉積多種不同的材料。
微擠出生物印表機已經用於製造多種組織類型，包括主動脈瓣，分支的血管樹和體外葯代動力學以及腫瘤模型。儘管對於高解析度複雜結構的製造時間可能較慢，但是已經構建了從臨床相關組織尺寸到微流體室中的微組織的構建體。
3.激光輔助生物列印
激光輔助生物列印（LAB）基於激光誘導的正向轉移的原理。最初開發轉移金屬，激光誘導正向轉移技術已成功應用於生物材料，如肽、DNA和細胞。雖然不太常見於噴墨或微擠出生物列印，但LAB越來越多地用於組織和器官工程應用。典型的LAB裝置由脈衝激光束、聚焦系統，具有通常由被激光能量吸收層（例如，金或鈦）覆蓋的玻璃製成的供體傳輸支撐體的「帶」在液體溶液中製備的生物材料（例如，細胞和/或水凝膠），以及面向帶的接收基底。LAB使用聚焦激光脈衝在帶的吸收層上產生將含細胞的材料推向收集器基底的高壓氣泡。
LAB的解析度受許多因素影響，包括激光能量密度（每單位面積傳遞的能量），表面張力，基底的潤濕性，帶和基底之間的空氣間隙，以及生物體的厚度和粘度層。因為LAB是無噴嘴的，所以避免了與其它生物列印技術困擾的細胞或材料堵塞的問題。LAB與一系列粘度（1～300 Pa/s）兼容，可以列印哺乳動物細胞，對細胞活力和功能的影響可以忽略不計。 LAB可以以高達108細胞/毫升的密度沉積細胞，使用5kHz的激光脈衝重複速率，每滴的單個細胞的微觀解析度，速度高達1 600mm/s。
儘管有這些優點，但是LAB的高解析度需要快速的凝膠動力學來實現高的形狀保真度，這導致相對低的總流速。對於每種印刷的細胞或水凝膠類型通常需要的每個單獨的帶的製備是耗時的，並且如果必須共同沉積多種細胞類型和/或材料，則可能變得繁重。由於帶狀細胞塗層的性質，可能難以精確地靶向和定位細胞。這些挑戰中的一些可以通過使用細胞識別掃描技術來使激光束能夠每個脈衝選擇單個細胞來克服。這種所謂的「瞄準和射擊」程序可以確保每個印刷的液滴包含預定數量的細胞。然而，統計細胞印刷可以使用具有非常高的細胞濃度的條帶實現，避免了對這種特異性細胞靶向的需要。最後，由於在印刷期間金屬激光吸收層的蒸發，金屬殘留物存在於最終的生物列印構造中。避免這種污染的方法包括使用非金屬吸收層和改變印刷過程以不需要可吸收層。這些系統的高成本也是基本組織工程研究的關注，儘管與大多數3D列印技術的情況一樣，這些成本正在迅速降低。
LAB用於製造細胞化皮膚構建體的應用證明了在層狀組織構建體中印刷臨床相關細胞密度的潛力，但是不清楚該系統是否可以按比例放大用於較大的組織大小。體內LAB已被用於在小鼠顱蓋3D缺陷模型中沉積納米羥基磷灰石。
在這些研究中，填充3mm直徑、600 μm深的顱蓋洞作為概念的證明。激光3D列印已被用於製造醫療設備，例如定製、非細胞的、可生物再吸收的氣管夾板，其被植入到具有局部氣管支氣管軟化的年輕患者中。未來的研究可能使用可直接整合到患者組織中的材料。另外，併入患者自身的細胞可促進這些類型的構建體對組織的結構和功能組分都有貢獻的適用性。
四、結語
經過以上闡述，讀者可以對三維生物列印技術中的主要成像技術和列印技術有一個詳細的了解。這些技術的發展得益於各個交叉學科的共同進步和發展，而三維生物列印技術則是將這些技術進行了系統性地整合和運用，使得它們可以更好地服務於人類社會關於精確治療的這個大目標。在三維生物列印技術中所使用到的成像技術，很多都發源於醫療成像技術，也算是醫學領域的延伸和發展。然而，列印技術卻得益於工業技術的發展，它的發展卻是與醫學相關性很少。人們創新性地將2種技術相結合，用細胞及其生長組件作為列印材料，推出並發展三維生物列印技術可以算是產業和生命科學的完美結合。這其中所體現的並不只是科學的進步，更是人類智慧的結晶。隨著醫療技術的深入發展，精確治療已經成為人類社會對醫療領域的行業期許和專業要求。在這樣的背景下，三維生物列印技術的蓬勃發展，一定可以為人類的醫療健康事業的高效安全可持續的發展提供巨大產業願景和技術保障。
文/宋宇
清華大學生物製造中心
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