第一次利用CRISPR基因組激活技術生成幹細胞 丁勝博士再獲重要突破
「調整一個位點就足夠了，這一點令人非常驚訝。「
CRISPR+iPS=？
幹細胞能夠分化成為機體內任何類型的細胞，既是研究人體早期發育的理想工具，也是細胞治療的寶貴資源。胚胎幹細胞很適合臨床使用，但獲得這些細胞會破壞胚胎，有很大的倫理爭議。2006年日本科學家山中伸彌開發了一個變通方案，用逆轉錄病毒將四個轉錄因子（OSKM）引入特化的成體細胞，再將其重編程為誘導多能幹細胞（iPSC）。這些細胞在實驗室中表現出與胚胎幹細胞相當的能力，又避開了胚胎幹細胞的倫理問題，在疾病模擬、藥物篩選和細胞治療中有著巨大的應用前景，被人們視為細胞療法的新希望。山中伸彌也因為iPS技術贏得了2012年的諾貝爾生理/醫學獎。
而CRISPR是指規律成簇的間隔短迴文重複，細菌通過CRISPR與內切酶Cas組成的防禦系統對抗外來侵略者。CRISPR-Cas能根據導R向NA的指引切割入侵者的遺傳物質。2012年研究者們利用這一特點，將CRISPR系統發展成了強大的基因組編輯工具。該系統可以簡單精確地編輯任何基因組區域，據說新手可在一周內學會用CRISPR編輯傳統的永生細胞系（比如HeLa或HEK293）。此外，研究者們還在CRISPR的基礎上開發了調控基因表達的新工具。
這兩種熱門技術的結合已經帶來了一加一大於二的效果：CRISPR用於人類iPSC可以揭示基因在特定疾病中起到的作用，甚至可以校正患者細胞的基因缺陷。
全新誘導多能幹細胞技術
來自Gladstone研究所，清華大學藥學院的研究人員利用CRISPR技術激活了一個特殊基因，完成了小鼠皮膚細胞向幹細胞的轉變過程，這種創新的方法提出了一種更簡單的生成有價值細胞類型的技術，並有助於了解細胞重編程過程的分子機制。
這一研究成果公布在1月Cell Stemm Cell雜誌上，由丁勝博士領導完成，這位早年畢業於北京大學的幹細胞專家在合成化學、幹細胞生物學以及藥物研發技術方面具有很強的科研實力和獨特見解，創造性地開拓了「幹細胞化學生物學」這一前沿性新領域。2015年他就任清華大學藥學院首任院長。
對於這項最新成果，他表示：「這是一種全新的誘導多能幹細胞方法，與之前的方法截然不同。在研究開始的時候，我們並不抱希望，但想至少可以解答這個問題：能否通過解鎖基因組的某個特定位置來重新編程一個細胞？答案是肯定的。」
多能幹細胞可以轉化為體內的任何細胞類型。因此是針對目前尚無法治癒的疾病，如心力衰竭，帕金森病和失明症的關鍵治療資源。同時多能幹細胞還為研究疾病提供了很好的模型，也可以在人體細胞中作為檢測新藥物的工具。因此也成為了生命科學領域的一大熱點。
不同於之前需要轉錄因子的誘導多能幹細胞，丁勝研究組的這種新方法採用的是化學試劑雞尾酒配方，這樣可以通過CRISPR基因調控技術直接操縱細胞的基因組，將皮膚細胞轉化為幹細胞。
「在誘導生成多能幹細胞的時候，可以有多種選擇，這對於在一種方法上遇阻的科學家來說十分有用。我們的方法是生成iPSCs的更簡單方法，可以被用來將皮膚細胞直接重編程為其它細胞類型，如心臟細胞或腦細胞」，丁勝博士說。
CRISPR是一個強大的工具，可以靶向DNA某段特殊序列來精確操縱基因組，之後DNA序列被永久刪除或替換，也可以暫時打開或關閉。
這一研究組主要靶向兩個基因：Sox2和Oct4，這兩個基因只在幹細胞中表達，科學家認為它們與多能性密切相關。這些基因和轉錄因子一樣，能開啟其他幹細胞基因，並關閉不同細胞類型相關的基因。
研究人員發現利用CRISPR可以激活Sox2，或者Oct4，實現細胞重編程。 他們指出，在基因組上一個單位點就足以開啟天然的連鎖反應，導致細胞重編程為iPSC。而傳統方法通過利用的是四種轉錄因子，更重要的是，一個轉錄因子通過能靶向細胞中數千個基因組位置，改變每個位置上的基因表達。
「調整一個位點就足夠了，這一點非常令人驚訝。接下來我們將會繼續了解這整個過程，即如何從一個單位點擴散到整個基因組的。」
技術指南
基本工作流程
在人iPSC中用CRISPR編輯基因或者控制基因表達，你需要開啟兩條平行的任務線：1）培養充足且可靠的多能幹細胞；2）針對目的基因設計20nt的導向RNA。
研究者們目前主要通過電穿孔遞送嚮導RNA和Cas9核酸酶，因為這種方法能在保證細胞存活的同時送入更多DNA和蛋白。你可以在市面上找到自動化的台式系統，比如Lonza的Nucleofector系統和ThermoFisher的Neon系統。Gladstone心血管病研究所的博士後Mohammad Mandegar奉勸大家，如果不是高通量細胞篩選，請不惜一切代價避免慢病毒遞送，因為人多能幹細胞似乎會天然沉默慢病毒送入的基因。
抗生素抗性可以幫助我們挑選經過編輯的克隆。研究者們一般將抗生素抗性、熒光報告基因和流式細胞儀結合起來，富集那些轉染成功的細胞，把它們鋪在單孔或多孔板上。通過追蹤細胞形態、多能性標誌物和細胞分化能力可以評估細胞的多能性。專家建議每10-20代或者每次細胞操作之後進行核型分析，確保細胞的染色體數量正常。
iPS細胞系如今有許多購買渠道，各大實驗平台和公司都提供有相應的服務。此外，iPS重編程方案也非常多。加州大學伯克利分校的細胞生物學家Dirk Hockemeyer表示，我們應當找到最適合自己的方案，在開始CRISPR編輯之前一定要很好地掌握這些細胞。
人多能幹細胞VS人腫瘤細胞系
專家們還建議，在著手iPSC之前先用人類癌細胞系試一試CRISPR-Cas9工具。在對iPSC動手的時候牢記一點：操作人iPSC更繁瑣、更講究也更加昂貴。
據介紹，有經驗的研究者用大約一個月的時間能學會基礎的人iPSC培養。由於新方案和試劑經常出現，操作這些細胞是一個不斷學習的過程，哈佛醫學院George Church實驗室的博士後Susan Byrne說。「我告訴本科生，如果在正確的指導下操作這些細胞，你們將在六個月內成為專家。但人們一開始總是低估了這種技術，」哈佛幹細胞研究所的Chad Cowan補充道。
請記住，每一個幹細胞系都是獨特的。這會影響細胞培養和嚮導RNA的效果 。「供體和重編程方法都會帶來變異，」Byrne說。「有時我們需要對特定幹細胞系進行方案優化。」一般來說，就算細胞系很健康、實驗方案很完美，人iPSC和ESC的編輯效率也會比癌細胞系低十倍，Johns Hopkins大學醫學院的Linzhao Cheng指出。
深入了解你的基因
知己知彼，百戰不殆。了解你想要編輯的基因座，認識那些可能轉錄的序列，可以幫助你設計出最佳編輯方案。舉例來說，有些基因在編輯之後仍能表現出一定的生物學活性。在這種情況下，你可能需要切割更大的區域。
選擇多個嚮導RNA並對它們進行測試。現在已經有很多軟體可以篩選嚮導RNA。不過，就算是特異性非常好的嚮導RNA也有可能效果不佳，甚至根本不起作用。造成這種情況的原因很多，比如你可能沒有足夠好的參考基因組。此外，你可能需要優化嚮導RNA的活性，加州大學聖地亞哥分校的生物工程師Prashant Mali說。他和George Church領導團隊在Nature Methods雜誌上發表文章，向人們展示了獲得活躍嚮導RNA的通用設計規則。
敲除VS精確編輯
當你用CRISPR-Cas9切割基因的時候，主要有兩個分子通路在執行DNA修復。這兩個同時發生的通路決定了基因編輯的精確性。非同源末端連接（NHEJ）負責敲除基因，製造破壞基因功能的小插入/缺失。同源介導修復（HDR）根據供體DNA精確改變核苷酸序列。
不少研究者在進行基因組編輯的時候使用偏向HDR的條件。他們發現，人多能幹細胞的編輯效果比傳統永生細胞系差，轉染100個iPSC只能引入一個正確的改變。這是CRISPR基因組編輯面臨的一個主要挑戰，不過Hockemeyer覺得自己的團隊還能應付。「如果你有很好地組織培養流程，那麼挑200個克隆就能獲得2個正確克隆。一個學生在三小時內就能搞定，」他介紹道。
Hockemeyer及其同事正在開發新策略，試圖讓天平向HDR傾斜，比如採用特殊化合物或者其他物種的Cas9。「我認為這個問題很可能未來幾年內就能得到解決，」Hockemeyer表示。
Conklin團隊開發了一種快速數字PCR測試，用來定量HDR和NHEJ的修復效率。他們的研究顯示，在人iPSC和其他一些細胞中，HDR和NHEJ效率之間並沒有什麼關係。
驗證你的基因組編輯
如何證明CRISPR系統完成了正確的切割呢？你可以給細胞提供與編輯基因互補的DNA，這些DNA應該能夠挽救相應的細胞表型。如果細胞表型變化很小難以觀察，你可以嘗試再次編輯這個基因，看看能否使其恢復成野生型，Hocke-meyer說。
研究者們也會抽查自己的基因組，比如對編輯區域進行PCR和Sanger測序。免費演算法TIDE（tide.nki.nl/; for Tracking of Indels by DEcomposition）可以在PCR和Sanger測序數據的基礎上鑒定目標突變及其發生的頻率。
外顯子組測序將成為驗證基因組編輯的首選方法。「測序可能是對你整個系統最完全的分析。如果這個細胞系要用上十年，那麼測序就是你應該做的投資。你需要確保一切都盡善盡美，」Mali指出。同時我們也應當請牢記，遺傳學差異會隨著時間的推移慢慢累積，任何細胞系都不例外。
脫靶效應並非大問題
針對同一個位點設計兩個以上有充分差異的嚮導RNA，這是防止脫靶編輯一個主要途徑。總的來說，脫靶效應對於絕大多數基礎研究者來說並不是什麼特別大的問題，Cowan認為。CRISPR系統在人多能幹細胞中的脫靶效應比癌細胞系少得多，Cheng也表示。但如果真的很擔心脫靶，全外顯子測序將是你最好的選擇。
用CRISPR調控基因表達
如果你指望在多能幹細胞中敲除多能性必需基因，那你肯定要失望了。因為敲除這些基因會導致細胞死亡。在這種情況下，我們只能選擇下調（或上調）基因的表達水平。研究者們為此打造了失去催化活性的dCas9，dCas9能到達嚮導RNA指定的位點，但無力對DNA進行剪切。用dCas9抑制轉錄的策略被稱為CRISPRi，用dCas9激活轉錄的策略被稱為CRISPRa。
基因表達控制和基因編輯之前的主要區別在於，基因表達控制並非永久性改變基因組。你可以干擾細胞沉默基因，然後再逆轉這種抑制。此外，與CRISPR-Cas9相比，CRISPRi和CRISPRa的脫靶效應更小。
CRISPR調控基因表達也存在一定的挑戰。舉例來說，設計一組可靠的嚮導RNA很難，Mali說。在理想情況下，嚮導RNA應當避開緊緊纏繞核小體的基因組區域。但有時候我們想要靶標的位點就在這些區域里。
將CRISPRa和CRISPRi送入人多能幹細胞也比較複雜。「使CRISPRa和CRISPRi進入70-80%的細胞依然很難，除非你使用病毒來遞送。通常我們說的都是30-40%的細胞，」Cowen指出，他正在用CRISPRa激活和驗證報告基因。這種方法對他很有幫助，因為iPSC很難分化成他想要的腎內皮細胞。
原文標題
CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency
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