治療非小細胞肺癌-山東大學2017 iGEM項目簡介

山東大學2017年iGEM參賽隊伍的基本信息：

iGEM比賽年度：2017年

隊名：SDU_CHINA

學校：山東大學（Shandong University）

類別（Kind）：大學生（Collegiate）

組別（Section）：本科生組（Undergraduate）

地區：亞洲

國家：中國

領域/板塊（track）：療法（Therapeutics）

山東大學2017年iGEM參賽隊伍的獲獎情況：

單項獎（Award）：最佳療法項目提名（Nominated for Best Therapeutics Project）

獎牌（Medal）：銅獎（Brozen Medal）

項目名稱：

Cancer Slayer─An invincible opponent of PD-L1

項目wiki：

http://2017.igem.org/Team:SDU_CHINA/

非小細胞肺癌（NSCLC）概述

肺癌是世界上癌症死亡的主要原因，而非小細胞肺癌（NSCLC）佔到了所有肺癌病人中的約80-85%。在非小細胞肺癌的臨床治療中，化療和放化療一直被用作一線治療藥物，但是缺乏療效並存在幾種毒副作用。逐漸地，免疫治療已經進入人們的視野，非小細胞肺癌免疫檢查點封鎖治療的成功近來獲得了廣泛的認可。通過使用抗體靶向程序化死亡蛋白1（PD-1）/程序化死亡配體1（PD-L1）軸的免疫檢查點封鎖治療在NSCLC患者中產生了有希望的臨床反應。然而，儘管多家公司通過檢測PD- L1在腫瘤細胞中已經引入臨床實踐，但由於PD-L1的動態表達，NSCLC腫瘤微環境中的突變/新抗原負載程度，腫瘤內異質性和浸潤的免疫細胞，對這些藥物的應答率是有限的。因此，我們需要更精確和有效的NSCLC治療方法。

圖1：各種癌症的發病率中肺癌是最高的。

非小細胞肺癌（NSCLC）約佔全部肺癌的85％。組織學上，NSCLC分為腺癌，鱗狀細胞癌（SCC）（見下圖）和大細胞癌。作為慢性炎症性疾病，腫瘤具有最複雜的機制和發展過程。儘管化療和放療發展迅速，分子靶向藥物治療仍然不容樂觀，5年生存率幾乎在15％以下。因此我們必須開發新的治療方法來戰勝非小細胞肺癌。

圖2：鱗狀細胞癌，一種非小細胞肺癌（NSCLC）的顯微照片。

PD-1/PD-L1概述

PD-1也被稱為CD279和CD28家族成員，是一種輔助抑制性受體，在腫瘤進展過程中的免疫逃逸中發揮著至關重要的作用。PD-1由胞外免疫球蛋白樣結合結構域，跨膜區和含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫受體酪氨酸基開關基序（ITSM）的胞質結構域組成。這些基序涉及其免疫抑制作用。PD-1配體如PD-L1（CD274）和PD-L2（CD273）是B7家族成員，已知其在腫瘤細胞表面被過表達以阻礙細胞毒性T細胞。

PD-L1在各種免疫細胞，上皮細胞和腫瘤細胞中廣泛表達。目前許多研究表明大量人腫瘤細胞表達PD-L1分子，其臨床病理特徵和預後與PD-L1表達密切相關，是腫瘤檢測和預後的一個新的生物學指標。腫瘤細胞與T細胞表面的PD-1結合，通過高水平表達PD-L1分子傳遞負調節信號，導致腫瘤特異性T細胞誘導的細胞凋亡和免疫功能喪失。通過抗體阻斷或任何其他方式干擾PD-L1和PD-1信號轉導，並通過加強來自TCR的信號傳導可以增強T細胞功能。

圖3：PD1依賴性抑制機制。

圖3中（A）顯示了對TCR信號體的直接抑制機制。該圖表示PD1-依賴的近端抑制機制，其依賴於所示的SHP1和SHP2磷酸酶的募集。這些磷酸酶抑制ZAP70和PI3K活性（藍色箭頭）。下游細胞內途徑也被終止，如圖中用ERK和PKCθ為例說明。

（B）通過調節CK2表達和活性顯示了對TCR信號傳導和T細胞增殖的間接抑制機制。左側顯示了激活CDK2和抑制SMAD3的PI3K依賴性信號傳導途徑。簡而言之，PIP3激活AKT，導致產生降解CDK2抑製劑Kip1的泛素連接酶SCF。活化的CDK2觸發細胞周期進程並通過磷酸化使SMAD3失活。這些途徑受降解PIP3的PTEN磷酸酶負調控。在TCR激活期間，CK2磷酸化PTEN，伴隨其活性降低。當PD1從事CK2表達和活動減少導致積活PTEN，消除PIP3並關閉AKT激活。

（C）通過PD1調節TCR表面表達。如圖所示，PD1參與促進CBL家族的E3泛素連接酶的表達。其他連接酶也可以被上調。這些泛素連接酶泛素化TCR鏈和PI3K，導致從T細胞表面去除TCR，可能是通過胞吞作用實現的。因此，T細胞不能對抗原刺激作出反應。

（D）PD1代謝控制。嚙合的PD1通過抑制ERK和PI3K-AKT活性將T細胞代謝從糖酵解改變為β-氧化。然後，PD1-刺激的T細胞將在代謝上變得類似於壽命長的記憶T細胞。

項目設計

儘管PD-1 / PD-L1的抗體已被用於顯示有前途的NSCLC的研究，但是抗體免疫療法並未提高五年存活率。這可能是由於遺傳材料的不變性導致的。研究顯示，基因版本作為一種免疫治療的新途徑，可以根除NSCLC發生的免疫逃逸。通過構建靶向編碼PD-1配體（PD-L1）的基因的Crispr-Cas9系統的質粒，預期PD-L1原位表達將被抑制，因此有希望恢復對腫瘤細胞的免疫系統監察。為了確保設計的安全性和防止基因污染，山東大學2017 iGEM團隊還構建了另一個帶有Crsipr-Cas 9系統的質粒，用於切除兩個質粒的管家基因。啟動子不在非腫瘤細胞中啟動Cas9表達，其中兩種質粒將自殺以確保生物安全性。預計這種新的方法可更有效，更經濟地治療非小細胞肺癌，使NSCLC的總體生存期變得更長。

圖4：CRISPR / Cas9基因組編輯的機制

基因電路設計

本項目致力於構建兩個基於CRISPR技術的質粒來切割癌細胞中的PD-L1基因，同時確保它們對於正常細胞是安全的。藉助sgRNA和腫瘤特異性啟動子，項目團隊設計的設備具有高靈敏性和高特異性，這意味著sgRNA可以將質粒引導至正確的切割位點，腫瘤特異性啟動子可以在適當的時間和適當的位置切換cas9的表達。項目的特異性在於PD-1配體基因被切斷後，轉移的質粒將自殺。即使質粒被轉移到正常細胞中，質粒也會裂解和降解。使用的基本質粒信息如下：

圖5：lentiCRISPR V2質粒圖譜

1.構建靶向切割PD-L1的第一個質粒

質粒的骨架是lentiCRISPR V2，如圖5所示。基於lentiCRISPR V2，項目團隊構建了第一個質粒，如圖6所示。U6啟動子用於表達靶向PD-L1的gRNA1，hTERT（人端粒酶逆轉錄酶）或survivin啟動子插入gRNA1和Cas9基因之間，其次是tetR。在這裡，gRNA1引導cas9酶找到切割位置; hTERT或存活蛋白啟動子是僅能在腫瘤細胞中開始表達的腫瘤特異性啟動子; tetR的蛋白可以與四環素操縱子結合。

圖6：第一個質粒的示意圖

hTERT啟動子僅在腫瘤細胞中開始轉錄，作為抗腫瘤基因的調控元件，啟動腫瘤細胞下游的抗腫瘤基因特異性表達，避免對正常細胞的損傷。存活蛋白屬於凋亡抑製劑家族（IAP），其拮抗細胞死亡的誘導。在癌症中經常觀察到IAP的失調錶達，並且腫瘤細胞中高水平的存活蛋白表達使其成為藥理學干預的有吸引力的靶標。

2.構建用於兩個質粒自殺的第二個質粒

第二個質粒的構建與第一個質粒相似。使用tetR阻抑型啟動子啟動cas9和gRNA2表達。在此，tetR阻遏啟動子可被第一質粒表達的tetR蛋白阻遏，所以在tetR存在的情況下它不能啟動cas9和gRNA2的表達。gRNA2被設計為針對兩個質粒的原始複製區域，並且可以指導cas9在用於質粒自殺的質粒上找到切割位點。

圖7：第二個質粒的示意圖

3.兩個質粒一起工作

由於hTERT和survivin啟動子在腫瘤細胞中的特異性，當構建的兩個質粒轉染到癌細胞中時，第一個構建的質粒將表達，而第二個構建的質粒將被tetR蛋白抑制。此外，gRNA1會引導cas9蛋白切斷PD-L1，癌細胞逐漸分化為正常細胞或死亡。那麼，我們將達到治癒癌症的目標。然而，如果將兩種質粒轉染到正常細胞中，則hTERT或存活蛋白啟動子將不起作用，tetR不表達，而tetR阻抑型啟動子將啟動Cas9和gRNA2的表達。後者將引導cas9蛋白質切割兩個質粒的原始複製區域以自殺，從而保證正常細胞安全。

圖8：兩個質粒一起工作的機制

綜上所述，項目團隊利用CRISPR / Cas9技術降低癌細胞表面的PD-L1表達，使T細胞識別癌細胞，恢復免疫抑制。他們將基因治療與免疫抑制治療緊密結合，為所有腫瘤治療帶來新的啟迪。

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