骨髓間充質幹細胞的示蹤技術研究進展
本文原載於《中華骨科雜誌》2017年第18期
骨髓間充質幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC）因其連續傳代培養和冷凍保存後仍具有多向分化潛能、自我複製、低免疫原性、方便提取培養及不受倫理學限制等特點，作為用於組織工程的理想種子細胞，受較多組織工程研究者的青睞[1,2]。但不少文獻表明骨髓間充質幹細胞在創傷修復上也存在諸如多次傳代的細胞增殖活力、分化潛能下降和易癌變等問題，目前仍然處於向臨床應用的轉化階段，因此仍需對其進行大量的基礎實驗研究。而在對細胞的基礎實驗中，需要明確目標細胞是否到達靶組織、增殖、存活等，以便證明該細胞的效果，由此細胞示蹤技術應運而生，即用標記物標記實驗細胞，追蹤標記物就能監測細胞的技術。然而運用於組織工程技術來構建組織的過程需要時間較長，要求在一定時間範圍內能檢測到標記物的存在；其次標記的細胞混雜在活體正常細胞中，標記的目的便是要容易識別出來；同時標記物最好不影響被標記細胞的特性與活性，因此標記系統的長期穩定性和無毒副性十分重要。因此，在當BMMSC移植後，研究人員希望能無創傷性地在活體內動態監測其的遷移分化和生存狀態，從而研究發展了多種示蹤技術。
根據標記物性質和標記方法的區別，目前大致可分為報告基因、熒光染料和納米粒子3大類標記方法，它們分別或聯合使用光學成像、MRI和核素成像（radionuclide imaging，RNI）等醫學影像技術中的一種或多種進行觀察，組成當前較為流行的幾種示蹤技術[3]。不同的標記方法和成像技術結合產生的示蹤技術有著各自的優勢與不足，這與所選擇的標記物本身的性質以及影像技術的特點有關。為了得到更準確的實驗結果，研究者也在不斷地改進和發展新的示蹤技術，因此在實驗中需結合實際情況選擇最佳的示蹤技術。
本文以"骨髓間充質幹細胞" 、"示蹤" 、"報告基因" 、"熒光染料" 、"納米粒子"等中文關鍵詞在中國知網、萬方資料庫進行檢索，並以"bone marrow mesenchymal stem cell" 、"tracer" 、"report gene" 、"fluorescent dyes" 、"nano particle"等英文關鍵詞在PubMed、Web of Science資料庫檢索，重點納入近3~5年的文獻，檢索語種為英文和中文。共檢閱出1 315篇文獻，其中英文文獻808篇，中文文獻507篇。設定文獻的納入標準：期刊論文和會議論文；研究內容與BMMSC的示蹤技術有關，包括基礎研究和臨床研究；同類型的文獻納入證據等級高的文獻。排除標準：無法獲得全文的文獻；信稿、報告類文獻；質量較低、證據等級不高的文獻；中、英文重複發表文獻。依納入及排除標準，最終納入文獻40篇，中文文獻16篇，英文文獻24篇（圖1）。我們希望通過對檢索出的關於骨髓間充質幹細胞示蹤方法的文獻進行歸納總結，對近年來應用的多種示蹤方法分析各自原理、優點及不足，為研究者選擇BMMSC的示蹤方法提供幫助，對BMMSC的示蹤技術研究進展進行綜述。
圖1
文獻篩選流程圖，最終納入文獻40篇（16篇中文文獻，24篇英文文獻）一、報告基因示蹤技術
隨著現代分子生物學的發展，特別是人類基因組測序工程的完成，大量基因技術應運而生，報告基因就是其中廣為應用的技術之一。報告基因示蹤技術的標記方法基本都是通過生物體結構，如質粒、病毒等載體攜帶報告基因轉染目標細胞，使該細胞表達特異性且不能分泌到細胞外的產物，通常產物為熒光蛋白、酶、受體等，通過檢測特異性產物來確定目標細胞的位置與生存情況（圖2）。
圖2
報告基因示蹤技術示意圖，報告基因與載體結合，轉染目標細胞，進入目標細胞內，報告基因結合到細胞核內DNA上，而載體在胞漿內被降解，隨後轉染成功的細胞核表達特定且不能被分泌到細胞外的產物（一）熒光蛋白
熒光蛋白是應用最為廣泛的示蹤劑，其中最有應用價值的是最早在維多利亞多管水母中提取的綠色熒光蛋白（green fluorecent protein，GFP）。而另一種較為常見的紅色熒光蛋白（red fluorecent protein，RFP）則是從珊瑚蟲Discosomagenus中克隆的一種與GFP同源的熒光蛋白，其發射波長大於GFP，組織穿透力強，因此不需要任何預處理便可檢測到[4]。熒光蛋白的發光原理為：其特有的生色團結構在較高能量的光子照射下發生構象改變，導致分子能級變化，從高能級的構象躍遷向低能級時發出較低能量的光子[5]。因此熒光蛋白需要激發光，但容易對發射光產生背景干擾，加之激發光和發射光波長均在可見光區域（400~760 nm），而活體組織對該波段熒光的強吸收和散射作用，和其他新的示蹤技術相比穿透深度低、空間解析度低、檢測靈敏度低。
（二）熒光素酶
熒光素酶報告系統是另一種相對成熟且運用廣泛的技術，主要有螢火蟲和海腎熒光素酶報告系統兩種，它們分別特異性利用熒光素和腔腸素和發光底物產生酶促反應，發出光子進行成像。對比熒光蛋白髮光原理，熒光素酶報告系統不需要激發光，其光能來源於酶促反應，因此只有在活細胞內才能發光，這可以很大程度上可以避免因激發光造成的光噪現象[6]。熒光素酶與底物結合特異性強，靈敏度高，內源性低，檢測方便準確，有其他報告基因技術無法比擬的優勢。Takashi等[7]構建了一個熒光素酶報告系統以更精確地監測各個階段間充質幹細胞的成骨分化情況。熒光素和腔腸素不產生交叉反應，這兩種熒光素酶可通過組合進行雙報告基因檢測：一個報告基因活性的改變，與基因表達的特定實驗條件相關；而另一個報告基因的組成型活性則提供內對照，使實驗值正態化，即可減少細胞轉染或裂解等變化因素帶來的誤差[8]。但無論哪種熒光素酶均存在成像空間解析度低、光穿透能力弱等缺陷，因此目前也僅適用於小動物活體成像。傳統熒光素酶較不穩定，室溫下即失活，需長期保存於低溫環境[9]。徐澍等[10]設計了耐熱突變日本螢火蟲熒光素酶使之在50℃時仍有活性，40℃下孵育25 min後活性仍>90%。Woo等[11]改進了海腎熒光素酶並命名為m-Rluc8，其發光強度是傳統熒光素酶的5.6倍。Hall等[12]開發了新的19 kd的NanoLuc熒光素酶和底物furimazine，使發光效率達到傳統熒光素酶的150倍。
（三）β半乳糖苷酶
β半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）是LacZ基因的表達產物，由4個亞基組成四聚體，較為穩定，用X-Gal為底物進行染色時呈藍色，便於檢測和觀察，即藍白篩選[13,14,15]。原本這種成像技術的檢測樣本來自組織解剖，不能在活體內觀察，但近年來研究者發現LacZ報告基因可用MR檢查來檢測。Louie等[16]通過轉基因細胞表達LacZ基因，並通過β-gal基質類似物激活反應產生MR檢查可檢測到的對比圖像。Bengtsson等[17]利用S-Gal在β-Gal存在時與三價枸櫞酸銨形成MR檢查可見的沉澱物，使之能在活體上直接觀察。
（四）鐵蛋白
鐵蛋白是一類普遍存在於生物體內，可以與鐵特異性結合來儲藏鐵的蛋白質，其有24個亞基組成一個內空心結構。每個亞基由輕鏈或重鏈的形式存在，輕鏈對鐵蛋白起穩定作用，而重鏈具有亞鐵氧化酶活性，將細胞攝取來的Fe2+氧化為Fe3+，Fe3+以高度不溶的Fe（OH）3的形式儲存於空腔內，使得Fe2+氧化反應持續進行，直至空腔內形成鐵核。每個鐵蛋白內約有4 500個鐵離子，可引起MR檢查的信號改變。大量體內外研究表明鐵蛋白的表達可明顯縮短MR檢查的T2時間弛豫，使得在T2WI中能檢測該報告基因的表達情況[18,19,20]。Naumova等[21]探測過表達鐵蛋白的幹細胞對比普通幹細胞可縮短25%的T2弛豫時間。相比於報告基因光學成像，MR掃描具有很高的組織穿透深度和解析度，同時又可以獲得解剖和生理信息。
二、熒光染料示蹤技術
熒光染料大多是含有苯環或雜環等帶有共軛雙鍵的化合物，含有能與核酸、碳水化合物和肽共軛連接的基團。該共軛物一般情況下穩定性好，在紫外或可見光的照射下，相比於其他的熒光物質或顏色標記物具有更優異的溶致變色效應，已成為一個很好的可供生物學研究（蛋白標記和DNA標記）使用的專門染料。熒光染料示蹤技術的標記方法無需通過生物體結構，染料能直接與目標細胞膜上特定位點或細胞內蛋白質結合，觀測熒光來確定目標細胞的位置和分裂情況（圖3）。常見的熒光染料主要有氯甲基苯甲醯胺（chlorobenzamide 1，1』-dioctadecyl-3，3，3』，3』-tetramethylindocarbocyanine，CM-Dil）、二脒基苯基吲哚（4』，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀醯亞胺脂（5，6-carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，CFSE）等。
圖3
熒光染料示蹤技術示意圖，熒光染料可與細胞膜結合，如CM-Dil；熒光染料也可進入細胞內與胞漿中蛋白質結合，如CFSE；熒光染料可與細胞核內DNA結合，如DAPI（一）CM-Dil
Dil是一種親脂性長鏈碳花青染料，易嵌入生物膜內並在膜內作定向擴散運動，從而標記整個細胞，熒光顯微鏡下發橙色光。還可以通過胞飲作用進入胞質，從而標記整個細胞質。Dil摻入膜中時熒光變強，穩定性好，熒光時間長，在標記細胞內消失慢，不容易在標記與非標記細胞之間傳遞，無細胞毒性[1]。CM-Dil為DiI的衍生物，是在DiI中加入氯甲基替代基團，使CM-Dil能夠抵抗醛類的固定作用及通透、脫水、石蠟包埋的影響，較DiI更適合標本長期追蹤，近年來已基本替代DiI在細胞示蹤方面的使用[22]。Al-Ani等[23]利用CM-Dil標記的骨髓間充質幹細胞和肌腱幹細胞治療大鼠跟腱斷裂，直到第4周仍能檢測得到。
（二）DAPI
DAPI是常用的核酸和染色體復染劑，與DNA的AT區域結合後，在紫外光激發下能發出藍色熒光，但目標細胞死亡後，DAPI可能被周圍細胞攝取而出現假陽性。Shang等[24]對照CM-Dil與DAPI標記大鼠骨髓間充質幹細胞的差異，發現CM-Dil組冰凍切片紅色熒光比DAPI組的藍色熒光邊界清晰且背景色低，CM-Dil組還可通過含細胞核染色的封片劑封片來排除熒光假陽性。
（三）CFSE
CFSE也稱5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester（CFDA SE），具有與細胞特異性結合的琥珀醯亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團。當CFSE以含有兩個乙酸基團和一個succinimidyl ester功能基團的形式存在時，不具有熒光性質，而具有細胞膜通透性從而進入細胞；而當其進入細胞內環境後，內源的酯酶將其乙酸基團水解，這時CFSE分子具有很高的熒光活性，被激發能夠產生綠色熒光，卻不再具有膜通透性；同時，其含有的succinimidyl ester基團能與細胞骨架蛋白中的遊離胺基反應，形成具有綠色熒光的蛋白加合物而存在於胞質中[25]。細胞經CFSE染色後，在分裂增殖的過程中，CFSE會平均分配到子代細胞中，使熒光強度呈指數減弱，雖然只適用於短時期示蹤，但可據此推斷目標細胞的傳代情況。Fayyad-Kazan等[26]運用CFSE標記T淋巴細胞在單獨和與BMMSC共孵育情況下培養5 d，應用流式細胞儀分析發現：共孵育的CFSE峰值下降近一半，證實BMMSC會抑制T淋巴細胞增殖。
三、納米粒子示蹤技術
有研究發現當物質的結構單元小到納米級，其性質就會發生重大改變，可以使材料在光學、催化、熱學、光化學以及敏感特性等方面具有一系列新特性。隨著納米技術在醫學領域的發展，一系列納米粒子如磁氧化鐵納米顆粒、量子點等被應用於示蹤技術，展現了它們巨大的優勢。納米粒子示蹤技術的標記方法最為簡單直觀，只需要納米粒子和目標細胞共孵育一段時間，細胞通過吞噬作用攝入納米粒子，檢測納米粒子即可了解目標細胞的位置（圖4）。
圖4
納米粒子示蹤技術示意圖，將納米粒子與目標細胞共孵育，目標細胞通過胞吞等作用攝入納米粒子，納米粒子在目標細胞內被囊泡包裹，不能被分解吸收，也不能排出細胞外（一）磁氧化鐵納米顆粒
磁性氧化鐵納米顆粒是近年來運用於細胞示蹤最多的納米粒子標記物，按其粒徑大小可分為超順磁性氧化鐵粒子（superparamagnetic iron oxide particles，SPIO）、超微磁性氧化鐵粒子（ultrafine magnetic iron oxide particles，USPIO）和單晶體氧化鐵納米粒子（monocrystalline iron oxide nanoparticles，MION），但大部分研究人員習慣用SPIO來標記幹細胞，因其對骨髓基質細胞具有高而穩定的標記率。SPIO無磁場時磁性極弱，但在很弱的磁場內就能表現出較大的磁性，這種磁性的變化就是超順磁性。SPIO在細胞中聚集，造成局部磁場不均勻，加速質子去相位過程，顯著縮短T2弛豫時間，從而使目標細胞在MRI上得到示蹤[27]。而單純的SPIO易聚集沉澱且表面所帶負電荷與細胞膜相斥，影響細胞吞噬，同時高濃度鐵具有一定細胞毒性且容易在細胞內被降解，故需對其表面進行修飾，目前多用的外殼是二氧化硅或多糖類聚合物[28,29]。無論外殼包裹鐵核心的結構還是成像原理都與鐵蛋白相似，可以說是一種分子層面的仿生。Naumova等[30]對比SPIO和鐵蛋白在治療小鼠心肌梗死的細胞移植示蹤實驗發現，SPIO在T2弛豫信號上強於鐵蛋白，但鐵蛋白能夠反映幹細胞是否存活。同時隨細胞分裂導致每個細胞內SPIO含量減少，MRI信號降低影響觀察；細胞死亡後SPIO又有可能被周圍巨噬細胞吞噬從而產生假陽性。
（二）量子點
量子點（quantum dots，QDs）是指可加工成粒徑為納米級的一類半導體納米晶體，傳統量子點主要是Ⅱ~Ⅵ族（CdTe、CdSe）或Ⅲ-Ⅴ族（InP、InAs）半導體組成[31]。應用於標記的量子點同樣為核/殼結構，如CdSe/ZnS（CdSe為內核ZnS為外殼）。內核決定其光學特徵，而外殼影響其水溶性、標記能力及穩定性[32]。理論上，傳統熒光物質能應用的技術領域，量子點也可以應用，而與傳統熒光示蹤技術相比，量子點還具有以下優勢：激發光譜寬、發射光譜窄、熒光強度強，穩定性好，可被多次激發，熒光壽命長，可實現長時間動態監測，顯著提高分析方法靈敏度和解析度；通過調節粒徑大小，可獲得更多不同熒光顏色的量子點[32,33,34]。然而傳統量子點高含量的重金屬Cd具有細胞毒性，限制了其應用[35]。一種解決方法是開發新的無毒的量子點，如低毒且價廉的碳量子點（CQDs）、更高空間解析度的近紅外二區硫化銀量子點（NIR-II Ag2S QDs）[36,37]；另一種解決方法是在傳統量子點上再包裹一層生物相容性的塗層，如Rizvi等[38]開發出的POSS-PCU外殼塗層。
綜上所述，三類示蹤技術在BMMSC修復組織或器官損傷時均已被大量使用，成為驗證實驗成功與否的有力證據。具體選用哪種示蹤方法，與研究目的、動物材料、靶組織的深淺、作用所需的時長、所需實驗結果的精確度等有關。
總體比較三類示蹤技術可發現：報告基因示蹤技術操作最為複雜，依靠生物體結構轉染細胞使標記率較低，在活體示蹤前需篩選，但報告基因能隨細胞分裂過程傳達給子代細胞，且幾乎只有在活細胞體內才能發揮作用，適合在小動物上檢測目標細胞是否存活及功能的研究，但同時也要考慮其轉基因的風險。而熒光染料示蹤技術直觀方便，能夠分析細胞繁殖情況，但鏡檢及鑒定時需要製備組織切片，且熒光時間較短，不適合活體長期示蹤，熒光染料亦會隨著細胞代謝減弱或者轉移到未標記細胞上從而導致靈敏度下降，在要求更加精確示蹤的今天已較少單獨使用。納米粒子示蹤技術則以簡單安全的操作手段，解析度、特異性、靈敏性、標記率基本均高於其他技術的巨大優勢成為熱門技術，但也存在無法確定細胞存活狀態、目標細胞死亡後出現假陽性等問題，作為一種新興技術，仍有發展的空間。
目前，研究者們除尋找新的示蹤技術以外，也提出將現有示蹤技術結合使用達到取長補短的效果，即聯合標記法和對其成像的多模態成像技術：如Cao等[39]利用CYI染料和USPIO聯合標記BMMSC，對其在大小鼠急性心梗模型上進行示蹤，可在高解析度定位同時掌握移植細胞存活狀況。而Nakamura等[40]則將thiol OS-MNP/Rho，一種可結合熒光染料的有機硅作為磁性氧化鐵納米顆粒外殼塗層。但聯合標記法同時也需要考慮經濟效益、原有示蹤技術缺陷的疊加放大以及是否會產生新的缺陷等問題。
總之，無論是尋找新技術還是改進舊技術，一個更為理想的示蹤技術不僅能使研究者更加清晰全面地了解BMMSC在體內外的各種狀態及功能，從而為BMMSC能夠更早地應用於臨床，還能促使不同學科領域技術互相"碰撞" ，擦出新的思維火花，進而推動科學進步。
「參考文獻略」
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