基因組編輯技術應用於作物遺傳改良的進展與挑戰
作者單位：中國農業科學院作物科學研究所，廣東省農業科學院水稻研究所
來源：中國農業科學 2018,51(1)：1-16
摘要：本文重點綜述了基因組編輯技術在作物遺傳改良上的應用進展、提出基因組編輯技術應用於作物改良的一般原則，最後討論該技術應用於作物育種的機遇和挑戰。
基因組編輯技術是指可以在基因組水平上對DNA序列進行定點改造的遺傳操作技術，其在基因功能研究和改造、生物醫學和植物遺傳改良等方面都具有重大的應用價值。科學家自20世紀90年代末就開始探索基因組定點編輯技術，但直到2002年，也僅在小鼠和果蠅等少數模式生物中實現了同源重組介導的基因組定點編輯，且因同源重組的效率很低，限制了其應用前景。進入21世紀後，隨著蛋白質結構與功能研究的新突破和人工核酸內切酶(engineeredendonuclease，EEN)技術的出現，將特異識別並結合DNA的蛋白結構域和EEN融合，創造出能夠特異切割DNA序列的核酸酶(sequence-specificnucleases，SSNs)，從而可以對基因組特定位點進行高效和精確的靶向編輯。
目前，SSNs主要包括鋅指核酸酶(Zincfingernucleases，ZFNs)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)、成簇的規律間隔的短迴文重複序列及其相關係統(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedCas9，CRISPR/Cas9system)和CRISPR/Cpf1系統。這些SSNs的共同特點是都能在基因組特定部位精確切割DNA雙鏈，造成DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strandbreaks，DSBs)；而DSBs能夠極大地提高染色體重組事件發生的概率。DSBs的修復機制在真核生物細胞中高度保守，主要包括同源重組(homology-directedrepair，HDR)和非同源末端連接(non-homologousendjoining，NHEJ)2種修復途徑(圖1)。當存在同源序列供體DNA時，以HDR方式的修復能夠產生精確的定點替換或插入；而沒有供體DNA時，細胞則通過NHEJ途徑修復。因NHEJ方式的修復往往不夠精確，在DNA鏈斷裂位置常會產生少量核酸鹼基的插入或缺失(insertion-deletion，InDel)，從而導致基因突變。
SSNs自2002年出現以後，就掀起了一股席捲全球的基因組定點編輯研究熱潮。尤其是2010年出現TALENs和2013年出現CRISPR/Cas9技術後，因它們相對簡單、精確、高效，很快被廣泛應用於醫學、農業、基礎研究等領域。因TALENs和CRISPR/Cas9潛在的巨大應用價值，它們相繼被《科學》雜誌評為2012年和2013年的十大科學突破之一。
一、基因組編輯技術在作物遺傳改良上的應用進展
目前，在作物遺傳改良上應用的基因組編輯技術主要包括ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas系統3種類型。其中CRISPR/Cas系統包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2等亞類型，但應用最多的是CRISPR/Cas9，而CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2尚無在作物改良上應用的報道。
上述3類基因組編輯技術均能對植物基因組進行精準的定點敲除、插入和替換，因此，其對於控制作物重要農藝性狀基因的功能鑒定、作物重要性狀的遺傳改良具有巨大的應用潛力。相比傳統的常規育種，基因組編輯技術能直接對目標性狀基因進行修飾，有可能大幅度提高目標性狀聚合的精準度和加快聚合育種進程。而相比傳統的轉基因育種，基因組編輯在靶向修飾特定基因後，能通過自交或雜交剔除外源基因以消除轉基因安全顧慮。因此，自基因組編輯技術成功應用於植物後，對該技術的優化及在作物遺傳改良上的應用已成為世界各國和國際農業生物技術公司投資與研發的重點。目前，基因組編輯技術主要集中應用於作物產量、品質、抗性、育性等4個方面的遺傳改良(表1)。現就技術類型和目標性狀分述如下。
1、ZFNs技術及其應用
ZFNs技術被稱為第一代基因組編輯技術。ZFN是一種人工改造而成的核酸內切酶，由鋅指蛋白的DNA結合域和核酸內切酶FokI的切割結構域組成。其中，DNA結合域通常由3—6個鋅指結構域(Zincfingerdomain，ZFD)串聯而成。一個ZFD能特異識別DNA鏈上3個連續的核苷酸鹼基，多個ZFD串聯後就能特異識別較長的核苷酸序列。FokI是一種非特異性核酸內切酶，在二聚體狀態時才有內切酶活性。因此，實際應用ZFNs打靶時，需要在靶點的兩側各設計一個ZFN。待2個ZFN結合到結合位點後，2個FokI相互作用形成二聚體，從而在靶點處切割DNA，產生DSBs。2002年，ZFNs首次成功應用於果蠅內源基因的定向突變。迄今為止，ZFNs技術已成功應用於人類幹細胞、大鼠、果蠅、斑馬魚、擬南芥、煙草和玉米等生物體的基因組編輯。
在作物改良方面，ZFNs技術迄今僅在玉米性狀改良上有一例報道，即2009年《Science》報道SHUKLA等利用ZFNs技術靶向突變玉米IPK1，獲得低植酸含量的玉米突變體。植酸鹽是穀物飼料的抗營養組分，低植酸鹽含量的穀物飼料能降低來自動物飼養作業所產生廢物流中的磷酸鹽污染。由於ZFNs的構建難度較大，普通分子實驗室難以操作，且成本高，預測其很難廣泛應用於植物基因組編輯。
2、TALENs技術及其應用
TALENs是繼ZFNs之後的第二代基因組編輯技術。TALEN結構與ZFN類似，也由DNA結合域和FokI的切割結構域融合而成。TALEN的DNA結合域為天然的或經改造的TAL效應子(TALeffector，TALE)蛋白結構域。天然的TALEs都具有高度統一的結構：即高度保守的N端和C端、中間部分的重複區。不同TALEs之間的差異主要在中間的重複區，其由33—35個氨基酸的重複單元組成，各重複單元除了第12和第13位氨基酸高度可變外，其他都高度保守，而這兩個高度可變的氨基酸組合被稱為重複可變區(repeat-variablediresidue，RVD)。2009年，BOCH等和MOSCOU等相繼破解RVDs與核苷酸鹼基之間的識別密碼(即NI或NS—A，NG—T，NN或NK—G和HD—C)，由此打開了人工構建靶向基因組任意位點TALENs的大門。TALEN的工作原理也與ZFN相似，TALE重複區的每個重複單元能特異識別一個特定的核甘酸鹼基，多個重複單元串聯後就能特異識別較長的核苷酸序列。實際利用TALENs打靶時，同樣需要在靶點兩側設計一對TALENs。與ZFN相比，TALEN載體的構建相對簡單、成本也更低、普通的分子生物實驗室都能操作；此外，TALEN技術基於重複單元與核苷酸鹼基一對一的識別模式，特異性更強，靶向編輯的效率更高。因此，自2010年TALENs技術出現後，便迅速取代ZFNs成為新一代的基因組編輯技術。
TALENs技術應用於作物遺傳改良最早見於水稻。2012年，LI等首次利用TALENs技術對水稻白葉枯病感病基因Os11N3(SWEET14)啟動子中的效應蛋白結合元件(effector-bindingelement，EBE)進行定點編輯，有效阻止了水稻白葉枯菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)分泌的效應蛋白(AvrXa7和PthXo3)與Os11N3啟動子結合，使該基因不受Xoo的誘導表達，從而提高了水稻的白葉枯病抗性。隨後，TALENs技術相繼在小麥、大豆和馬鈴薯等主要作物的重要性狀改良上獲得成功。
MLO(MILDEW-RESISTANCELOCUS)是大麥、小麥等作物中白粉病菌成功侵染所必需的基因，該基因突變後，大麥表現出對白粉病菌的持久、廣譜抗性。2014年，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊利用TALENs技術同時靶向突變小麥MLO的3個拷貝，獲得了3個拷貝都突變的純合突變體，該突變體小麥對白粉病菌表現極為顯著的抗性，證明TALENs技術能對小麥這樣的多倍體植物進行定向遺傳改良。同年，美國Cellectis公司研究人員通過TALENs技術靶向突變大豆脂肪酸脫氫酶基因FAD2-1A和FAD2-1B，獲得的雙基因突變體中油酸含量由20%提高到80%、亞油酸含量由50%降至4%，極大地改善了大豆油的品質；隨後，該公司又通過TALENs技術靶向修飾馬鈴薯的VInv，改良了馬鈴薯的耐冷藏和加工性。此外，SHAN等利用TALENs技術敲除水稻品種日本睛的OsBADH2，使無香味的稻米產生了香味；MA等利用該技術敲除水稻脂肪氧化酶基因Lox3，改良了水稻種子的耐貯藏性；BLANVILLAIN-BAUFUME等利用該技術對水稻白葉枯病感病基因SWEET14啟動子中效應蛋白AvrXa7和Tal5、TalC的EBEs進行定點編輯，使感病水稻品種的白葉枯病抗性提高到中抗以上水平。
3、CRISPR/Cas9技術及其應用
CRISPR/Cas是細菌和古細菌抵禦病毒和外源DNA入侵的適應性免疫系統。目前，CRISPR/Cas系統可分為兩大類。第一大類由多個Cas蛋白組成的複合體行使生物學功能，第二大類由單個Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1和C2c2)行使生物學功能。CRISPR/Cas9屬於II類，僅需要成熟的crRNA(CRISPR-derivedRNA)、tracrRNA(trans-activatingRNA)和Cas9蛋白就能實現對外源DNA的切割。
經人工改造的CRISPR/Cas9系統主要由引導RNA(singleguideRNA，sgRNA)和Cas9蛋白結構域組成。其中，sgRNA起精確定位作用，其5′端前20個核苷酸鹼基決定Cas9蛋白特異性切割基因組DNA的部位；Cas9蛋白包含類HNH核酸酶結構域和類RuvC核酸酶結構域，分別負責切割靶DNA互補鏈和非互補鏈DNA。CRISPR/Cas9系統在工作時，sgRNA和Cas9形成一個嵌合蛋白，該嵌合蛋白切割與sgRNA5′端前20-nt互補的基因組DNA雙鏈，產生DSBs，最後通過HDR或NHEJ修復途徑產生基因突變。2013年，CPISPR/Cas9系統成功實現人類細胞的基因組定向編輯，隨後被迅速應用於人類、動物和植物等的基因組編輯，並超越TALENs成為第三代基因組編輯技術。
CRISPR/Cas9系統具有構建簡單、編輯效率高、容易實現多基因編輯等優勢，現已成為應用最廣泛的基因組編輯技術，在作物遺傳改良和品種培育上具有重大應用潛力。目前，CRISPR/Cas9技術已成功應用於多種作物如水稻、玉米、小麥、大豆、番茄、柑桔和蘑菇的重要農藝性狀遺傳改良。
1）在作物產量和品質改良上的應用
LI等以水稻品種中花11為材料，利用CRISPR/Cas9技術對水稻產量負調控基因Gn1a(每穗實粒數)、DEP1(直立型密穗)、GS3(粒長和粒重)和IPA1(穗粒數、分櫱相關)進行定點修飾，發現Gn1a或DEP1、GS3突變後水稻的每穗實粒數或著粒密度、粒長都明顯增加，但DEP1突變體在著粒密度增加的同時有半矮化現象，而GS3突變體在粒長增加的同時芒也顯著增長。類似地，SHEN等利用CRISPR/Cas9技術對5個粳稻品種的GS3和Gn1a進行定向敲除，構建了5個粳稻背景的gs3和gs3gn1a突變系，所有突變系稻穀粒長相比其野生型都增加，所有gs3gn1a突變系的主穗粒數相比其野生型也都增加，單株產量增幅最高達14%。此外，XU等通過該技術靶向突變水稻GW2(粒寬和粒重)、GW5(粒寬和粒重)和TGW6(千粒重)基因後發現，gw2gw5tgw6和gw2gw5純合突變系的粒長、粒寬和粒重相比其野生型都顯著增加。WANG等利用CRISPR/Cas9技術對秈稻DEP1進行定點突變發現，獲得的大片段缺失突變體水稻著粒密度增加、植株變矮，產量增加。
直鏈澱粉含量與水稻品質密切相關。MA等利用CRISPR/Cas9技術靶向突變直鏈澱粉合成酶基因OsWaxy，突變體直鏈澱粉含量從14.6%下降至2.6%，由此獲得了糯性品質。SUN等利用該技術對水稻糖苷水解酶基因BE1和澱粉分支酶IIb基因BEIIb進行定點編輯，BE1突變株相比野生型在粒型、總澱粉含量、直鏈澱粉含量等指標上未有顯著差異，但BEIIb突變株相比野生型粒型顯著變小、總澱粉含量和直鏈澱粉含量顯著增加，後者最高達到25%。
在小麥產量改良上，ZHANG等利用瞬時表達CRISPR/Cas9系統對小麥粒長和粒重負調控基因TaGASR7和直立型密穗基因TaDEP1定點編輯，獲得的TaGASR7純合突變株粒重顯著增加，TaDEP1純合突變株明顯變矮。
在番茄生育期和產量改良上，SOYK等通過CRISPR/Cas9技術對一種感光野生番茄的抗成花基因SP5G進行定向修飾。結果顯示SP5G突變後，番茄開花和成熟時間提前了約2周，且掛果量增加、產量顯著提升。
雙孢菇(Agaricusbisporus)非常容易褐變，從而影響其品質。賓夕法尼亞州立大學伯克分校的楊亦農實驗室利用CRISPR/Cas9技術對雙孢菇的1個多酚氧化酶基因PPO進行定向修飾，獲得的DNA-free突變雙孢菇中多酚氧化酶的活性降低了30%，並具有了抗褐變能力。而抗褐變蘑菇於2016年4月成為第一個豁免美國農業部監管的CRISPR編輯作物。
綜上，利用CRISPR/Cas9技術對控制作物產量、品質相關的負調控基因進行定向修飾，能不同程度地改良作物的產量、品質和株型等，是作物高產優質育種的新途徑。
2）在作物抗病、抗逆性改良上的應用
稻瘟病是危害水稻最嚴重的病害之一。水稻OsERF922是一個ERF(ethyleneresponsivefactors)類轉錄因子基因，負調控水稻對病瘟病的抗性。中國農業科學院作物科學研究所趙開軍團隊以稻瘟病感病品種空育131為材料，利用CRISPR/Cas9技術靶向敲除OsERF922，獲得的T2純合突變系在苗期和分櫱期對稻瘟病菌的抗性相比野生型都有顯著提高。柑桔潰瘍病是柑桔生產上最嚴重的病害之一，CsLOB1是導致柑桔潰瘍病的關鍵感病基因。JIA等利用CRISPR/Cas9技術對CsLOB1的編碼區進行定點編輯，獲得的突變體植株對潰瘍病的抗性顯著增強。
隨著作物輕簡化栽培技術的普及，除草劑在作物生產上的使用日益廣泛，因此培育抗除草劑的作物新品種成為重要的育種目標。乙醯乳酸合酶(acetolactatesynthase，ALS)是支鏈蛋白質合成通路中的第一個常見酶，ALS中特定氨基酸突變可以提高植物對乙醯乳酸合酶類除草劑的抗性。2015年，美國杜邦先鋒公司通過CRISPR/Cas9技術將玉米ALS2編碼區的第165位脯氨酸突變為絲氨酸，獲得了抗氯磺隆的玉米突變體。通過類似的策略，中國農業科學院作物科學研究所夏蘭琴團隊和美國加州大學聖地亞哥分校趙雲德團隊合作，將ALS編碼區特定鹼基定點替換，導致2個氨基酸(W548L和S627I)變異，獲得了抗磺醯脲類除草劑的水稻。同時，ENDO等也通過類似的方法，獲得了ALS編碼區W548L和S627I位置處鹼基定點替換的水稻突變體。此外，中國科學院遺傳與發育生物學研究所的高彩霞團隊和李家洋團隊合作，利用NHEJ修復方式建立了基於CRISPR/Cas9的基因組定點插入及替換系統，並利用該系統獲得了在OsEPSPS基因保守區2個氨基酸定點替換(T102I和P106S)的雜合突變體，其對草甘膦具有抗性。最近，SHIMATANI等等通過基於CRISPR/Cas9的Target-AID(target-activation-inducedcytidinedeaminase)方法，將水稻ALS編碼區的第96位丙氨基酸突變成纈氨酸，獲得了抗磺醯脲類除草劑的水稻突變體。
玉米ARGOS8是一個乙烯響應的負調控因子，在乾旱脅迫過表達ARGOS8的玉米比野生型顯著增產。SHI等利用CRISPR/Cas9技術，將玉米GOS2啟動子(能賦予中等水平的組成型表達)定點插入ARGOS8的5′-非翻譯區或直接替換ARGOS8的啟動子，獲得ARGOS8表達量顯著增加的突變體。這些突變體在乾旱環境下，其最終產量相比野生型玉米顯著提升。這是目前首次報道利用CRISPR/Cas9技術通過調節靶標基因的表達量來改良作物遺傳性狀的案例。
總之，通過CRISPR/Cas9技術定點敲除作物抗性負調控因子基因，或定點修飾抗逆性正調控基因的啟動子以增強基因的表達，或對抗性相關基因編碼區定點替換改變基因功能，都能在不同程度上改良作物的抗病或抗逆性，是作物抗性分子育種的有效途徑。
3）在創製水稻雄不育繫上的應用
光溫敏核雄性不育系(P/TGMS)的發現使雜交水稻由三系法向兩系法發展。使用傳統的方法，培育一個新的光溫敏核雄性不育系通常需要幾年甚至十年以上時間，但利用CRISPR/Cas9技術可以大大加快培育水稻雄不育系的進程。2016年，上海交通大學生命科學技術學院張大兵團隊利用CRISPR/Cas9技術靶向編輯粳稻品種空育131內源基因csa(CarbonStarvedAnther)，獲得了粳型光敏核雄性不育系。同年11月，華南農業大學生命科學學院的庄楚雄團隊利用CRISPR/Cas9技術對水稻溫敏核雄性不育基因TMS5進行特異性編輯，創製了一批溫敏核雄性不育系。可見，CRISPR/Cas9技術為水稻兩系不育系的培育提供了一條新的便捷途徑。
4、CRISPR/Cpf1技術及其應用
CRISPR/Cpf1隸屬於II類typeV-ACRISPR系統，是迄今發現最簡單、有效的II類CRISPR/Cas系統。CRISPR/Cpf1特異切割DNA雙鏈的原理與CRISPR/Cas9相似，但其作用機制不同。Cpf1是Cas蛋白的一種，其功能與Cas9類似，目前AsCpf1(Acidaminococcussp.Cpf1)、LbCpf1(LachnospiraceaebacteriumCpf1)和FnCpf1(FrancisellanovicidaCpf1)已被證實具有DNA切割及執行RNA加工的活性。Cpf1蛋白由具有識別sgRNA功能的a-REC區域和具有核酸酶功能的NUC區域構成。a-REC包含REC1和REC22個識別結構域；NUC主要包含RuvC結構域、WED(wedge)結構域、一種推定的核酸酶(Nuc)結構域和PI(PAM-interacting)結構域，其中，Ruv-C和Nuc核酸酶分別負責切割靶DNA的非互補鏈及互補鏈的不同位點，由此產生具粘性末端的DSBs。不同於SpCas9(StreptococcuspyogenesCas9)，Cpf1僅需一個42-nt的crRNA(3′端有23-nt與靶DNA序列互補)，就能對靶DNA雙鏈進行切割。另AsCpf1和LbCpf1的PAM識別區鹼基為5′-TTTN-3′，FnCpf1的PAM識別區鹼基為5′-TTN-3′，不同於SpCas9的5′-NGG-3′。此外，Cpf1與SpCas9切割機制也不一樣，SpCas9切割靶DNA互補鏈的4位和非互補鏈的16位，形成一個平末端；而Cpf1切割靶DNA互補鏈的23位和非互補鏈的18位，形成一個5-nt的粘性末端。但最新的研究結果表明，Cpf1並非只切割靶DNA非互補鏈的18位，而是在非互補鏈的14—18位間多個位點切割。當spacer序列長度≥20-nt時，Cpf1傾向於切割互補鏈的18位；當spacer序列長度
目前，CRISPR/Cpf1技術已成功應用於煙草、大豆和水稻的基因組編輯。2016年，ENDO等首次將CRISPR/Cpf1系統成功移植於煙草和水稻的基因組編輯，他們將FnCpf1和crRNA融合開發了Cpf1-crRNA系統，在煙草和水稻中的編輯效率最高可達90%。隨後，XU等將LpCpf1分別與pre-crRNA和加長pre-crRNA融合構建了crRNA-Cpf1系統，在水稻中的編輯效率最高可達41.2%；HU等也將LpCpf1和crRNA整合開發了CRISPR-Cpf1系統，並利用該系統成功實現水稻內源基因的定點編輯；KIM等開發了Cpf1–RNP(ribonucleoprotein)系統，並成功利用該系統對大豆和煙草的內源基因進行定點突變。此外，BEGEMANN等將Cpf1、crRNA和供體片段構成融合表達載體，對水稻葉綠素a加氧酶基因OsCAO1進行定點編輯，獲得了在靶點產生的預期InDel突變和片段插入，此外純合突變植株整株都產生黃化現象。TANG等針對Cpf1蛋白及crRNA的表達特性，構建了PolII型啟動子融合核酶(ribozyme)驅動的Cpf1和crRNA植物表達單元，並成功對水稻內源基因OsPDS、OsDEP1和OsROC5進行定點突變。WANG等將4個DR(directrepeats)-guide單元組成的crRNA分別與FnCpf1和LbCpf1融合構建CRISPR/Cpf1系統，並利用該系統簡單、高效地實現了水稻多基因定點編輯。
CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas9一樣，都是目前最為簡捷、高效和最易實現多基因編輯的基因組編輯技術。兩者表達載體的構建都相當簡單，且都只需要串聯多個crRNA即可實現多位點編輯，而編輯效率和特異性也都相當，另因都受PAM識別位點的限制，編輯範圍也都有一定的局限性。因此，CRISPR/Cpf1與CRISPR/Cas9可以說是不相伯仲的基因組編輯技術，相當於CRISPR/Cas技術「廚房」兩把效果一樣但又能互補的「剪刀」，作為「廚師」的我們，只要能達到我們的目標，選擇任一「剪刀」都可。
5、利用CRISPR/Cas系統在基因組編輯方式上的技術創新
1）植物基因組單鹼基編輯系統創新和應用
單鹼基突變可引起作物許多農藝性狀的改變，因此，實施單鹼基編輯對作物遺傳改良具有十分重要的意義。2016年5月，《Nature》報道了KOMOR等將大鼠胞嘧啶脫氨酶(APOBEC1，一種鹼基修飾酶能改變DNA序列)、Cas9變體(D10A)和尿嘧啶糖基化酶抑製劑(UGI)融合構建了大鼠基因組單鹼基編輯系統，並用該系統成功糾正了小鼠細胞中阿爾茨海默病相關的突變，單鹼基替換效率高達75%。隨後，有4個研究團隊將該系統成功改造並用於糧食和蔬菜作物(水稻、小麥、玉米、番茄)的基因組單鹼基編輯。
2016年12月，中國科學院上海生命科學研究院朱健康團隊，以及夏蘭琴和趙雲德合作團隊同時在《MolecularPlant》上發表了其在植物基因組單鹼基編輯上取得的最新成果。朱健康團隊將APOBEC1通過非結構化的16殘基肽XTEN作為接頭，融合到Cas9(D10A)的N末端，並將核定位信號(NLS)肽添加到Cas9(D10A)的C末端，構建了APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)植物基因組單鹼基編輯系統。利用該系統對水稻NRT1.1B和SLR1進行編輯，結果表明該系統能在靶位點產生預期的CT(GA)鹼基替換，NRT1.1B和SLR1在靶位點產生預期突變的效率分別為2.7%和13.3%。夏蘭琴和趙雲德合作團隊也利用APOBEC1、Cas9變體(nCas9-D10A)和UGI的融合基因BE3構建了植物基因組單鹼基編輯系統pCXUN-BE3。利用pCXUN-BE3系統編輯水稻八氫番茄紅素脫氫酶基因OsPDS和澱粉分支酶IIb基因OsSBEIIb，獲得在3個靶位點產生預期突變(靶序列5′端4—8位置有GA或CT)的水稻植株，效率最高可達20%。
2017年2月，《NatureBiotechnology》雜誌報道了高彩霞實驗室在水稻、小麥和玉米基因組中實現高效、精確的單鹼基編輯的成果。他們同樣利用APOBEC1、nCas9-D10A和UGI，構建了植物基因組單鹼基編輯系統nCas9-PBE。利用該系統對3種作物5個內源基因7個靶位點的定點突變結果顯示，在靶序列5′端3—9位置能產生預期的CT的替換，其中，單個C的替換效率為0.39%—7.07%，多個C的替換效率高達12.48%；而遺傳轉化的結果表明，該系統在小麥、水稻和玉米中獲得靶區域單鹼基替換的效率最高可達43.48%。同年3月，SHIMATANI等在《NatureBiotechnology》雜誌發表了其在水稻和番茄中實現高效的單鹼基編輯的最新成果。將nCas9-D10A(nCas9)、PmCDA1(Petromyzonmarinuscytidinedeaminase)和sgRNA融合構建了植物基因組單鹼基編輯系統nCas9-PmCDA1，並利用該系統對水稻ALS和FTIP1e以及番茄DELLA和ETR1進行定點突變。結果表明，在水稻中該系統在靶區域誘導單個或多個預期單鹼基替換(CT)的效率最高可達50%，在番茄中最高可達80%。
2）DNA-free植物基因組編輯系統創新和應用
生物安全問題是限制轉基因作物商業化的主要因素。雖然CRISPR/Cas對基因進行定點修飾後能通過自交後代分離剔除外源DNA，獲得無外源DNA基因(DNA-free)的編輯植株。但目前只有美國對CRISPR編輯作物安全實行監管豁免，其他國家都還處於觀望狀態。因此，建立全程DNA-free的植物基因組編輯系統對於推動基因編輯作物的商業化利用具有重要意義。目前，DNA-free植物基因組編輯系統主要有瞬時表達CRISPR/Cas9編輯系統和RGEN(RNA-guidedengineerednuclease)核糖核蛋白(RGENribonucleoproteins，RGENRNPs)編輯系統。
瞬時表達CRISPR/Cas9編輯系統的操作流程和原理是：將CRISPR/Cas9質粒DNA(TECCDNA)或其轉錄的RNA(TECCRNA)通過基因槍法直接轉入植物愈傷組織，因是環狀質粒或RNA，故不易被整合進植物基因組中；在完成切割使命後，質粒DNA或RNA會被細胞內源核酸酶分解，從而實現全程DNA-free的基因組編輯。研究人員對該系統在小麥基因組中的定向修飾特性進行了詳細的研究。通過對4個小麥品種的7個內源基因(共9個靶位點)靶向修飾發現，TECCDNA在小麥T0轉基因植株中誘導突變的效率為1.0%—9.5%，DNA-free突變植株的比例為43.8%—86.8%。對比分析顯示，TECCDNA和經典CRISPR/Cas9系統的定向編輯效率和脫靶效應上沒有明顯差別，但都顯著高於TECCRNA。
RGENRNPs技術是將CRISPR-Cas蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白複合體，該複合體進入細胞後能迅速行使DNA切割功能，然後被細胞內源蛋白酶快速分解，從而實現全程無外源DNA整合的基因組編輯。RGENRNPs技術最先應用於低等動物和人類細胞，隨後被應用於擬南芥、煙草、萵苣、水稻、矮牽牛花、玉米、小麥和大豆的基因組編輯。2015年，WOO等首先將RGENRNPs技術成功用於植物的基因組編輯。研究表明，RGENRNPs在擬南芥、煙草和水稻的原生質體中定向編輯的效率分別為16%—19%、17%—44%和8.4%—23%，在轉化萵苣的再生植株中定向編輯的效率為45.7%，且沒有檢測到脫靶突變。此外，SUBBURAJ等通過RGENRNPs技術對矮牽牛花內源基因PhNR(nitratereductase)的6個位點(NR1-6)進行定向修飾，發現在原生質體中RGENRNPs誘導定點突變的平均效率為(11.5±2)%。顯然，這兩項研究只聚焦在植物原生質體層面的基因組定向修飾，還未真正涉及作物的遺傳改良。
2016年11月，《NatureCommunications》報道了美國杜邦先鋒公司利用RGENRNPs技術獲得了無葉舌、雄性不育和抗氯磺隆的玉米改良系，標誌著RGENRNPs技術在主要作物遺傳改良上的真正應用。研究人員通過基因槍法將組裝好的RGENRNPs，及RGENRNPs和同源供體片段轉入玉米愈傷組織，通過NHEJ途徑實現對玉米無葉舌基因(LIG)、雄性育性基因(Ms26和Ms45)進行定點突變，通過HDR途徑實現對ALS2基因定點替換(編碼區的第165位脯氨酸突變為絲氨酸)，最終獲得了全程無外源DNA作為載體的DNA-free基因編輯玉米，表現為無葉舌、雄性不育和抗氯磺隆；對比分析發現，RGENRNPs和Cas9-gRNA質粒(即TECCDNA)定向編輯效率基本一致，但RGENRNPs誘導的脫靶效應顯著低於Cas9-gRNA質粒誘導的。類似地，LIANG等利用RGENRNPs技術對小麥TaGW2進行定向編輯，深度測序結果表明CRISPR/Cas9RNP定向編輯的效率較CRISPR/Cas9DNA要低，脫靶的機率也更低，且在突變植株中未檢測到脫靶現象.
上述報道都是基於CRISPR/Cas9RNP的DNA-free植物基因組編輯。2017年，KIM等首次利用CRISPR/Cpf1RNP成功對大豆FAD2和煙草AOC實現定點編輯，效率最高達11.7%，且在大豆基因組潛在脫靶位點未檢測到顯著突變。
二、基因組編輯技術應用於作物改良的基本原則
1、ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas如何抉擇
ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas都是有效的基因組編輯技術，但三者在設計、特異性和效率上各有不同。ZFNs由於特異性不高、脫靶問題嚴重及獲得ZFN蛋白非常困難，嚴重阻礙了其廣泛應用。TALENs的優點是特異高、脫靶效應低，但載體構建較繁瑣、編輯效率不是很高、且難以同時對多個基因進行編輯。CRISPR/Cas系統的優點是編輯效率非常高，設計和構建極其簡單(只需2—3d)，僅需設計、合成靶點識別序列，且也只需將sgRNA串聯就能實現多基因編輯；但CRISPR/Cas系統的特異性稍差，存在較明顯的脫靶效應，另受PAM識別位點限制。目前，ZFNs已基本被TALENs和CRISPR/Cas系統所取代，而TALENs在植物基因組編輯中也已逐漸失去優勢。因此，在作物遺傳改良上，優先推薦使用CRISPR/Cas系統，如CRISPR/Cas系統無合適的靶位點或對特異性要求極高的情況下可使用TALENs技術。
2、基因敲除還是基因替換
目前，基因編輯技術應用於作物遺傳改良主要有兩種方式，一是通過靶向敲除目標性狀負調控基因，造成該基因功能缺失，以改良目標性狀；二是通過對目標性狀控制基因進行定點替換，導致該基因功能發生改變，從而獲得新的目標性狀。因此，在實踐中運用基因組編輯技術對作物進行遺傳改良時也要分以下2種情況：一是對於目標性狀起負調控作用的基因採取基因敲除的方式，目前，絕大部分基於基因組編輯技術的作物遺傳改良都是通過此方式實現的，如WANG等對水稻稻瘟病抗性的改良、ZHOU等創製水稻溫敏核雄性不育系等；二是對於目標性狀的獲得是因目標基因突變導致基因功能發生改變的基因，採用基因定點替換的方式，如抗除草劑水稻、玉米等都是通過基因定點替換而獲得的。
3、靶位點如何選擇
目前，已有多個專門設計SSNs靶位點和搜索脫靶位點的網站和工具。而在作物遺傳改良的實際操作中，是敲除多基因還是單基因、靶位點在基因上的位置及數目都是需要考慮的。如果需要同時改良多個目標性狀，以及目標性狀是由微效多基因或多等位基因控制的情況，最好針對每個目標性狀控制基因，或微效多基因等設計多個靶位點進行定向敲除，能最快、最省地獲得改良目標性狀；而如果控制目標性狀的是主效基因，則敲除單個基因一般即可達到改良目的。
靶位點在基因上的位置也比較重要，進行基因敲除時，靶位點應優先選擇在起始密碼子附近，或在特定的功能域(可能引起密碼子缺失和移碼)；而如果是基因替換，靶位點則需選擇在基因特定功能區(突變後基因功能發生改變的區域)。此外，靶位點的數量也關係到定向編輯的效率和遺傳轉化的規模，筆者在試驗中發現，敲除同一個基因時分別設計1個、2個和3個靶點進行修飾，突變的效率分別為42%、70%(2個靶點都突變的為63.3%)和90%(3個靶點都突變)，獲得純合突變株的效率分別為14.3%、47.6%和40.7%。因此，在基因敲除時，建議單個基因設計2個靶位點，能減輕遺傳轉化的工作量，也能更省、更快地獲得純合突變植株，極大地節省人力和物力。
4、如何快速獲得純合的DNA-free編輯植株
目前，獲得純合的DNA-free編輯植株主要有2種途徑：一是通過經典的TALENs和CRISPR/Cas9技術獲得基因得以修飾的植株後，通過自交或雜交的方式剔除外源基因；二是直接利用DNA-free植物基因組編輯系統對植物基因組進行定向編輯。2種途徑都有各自的優缺點，通過自交或雜交剔除的途徑相對來說操作簡單、成本低，普通的分子實驗室都能操作完成，且最快能在T1代獲得純合的DNA-free編輯植株。DNA-free植物基因組編輯系統的優勢在於能得到全程無外源DNA整合的編輯植株，且在T0代即可獲得純合的DNA-free編輯植株，但相對經典的CRISPR/Cas9系統操作較複雜、成本更高。因此，想要最快獲得純合的DNA-free編輯植株，有條件的實驗室優先推薦使用RGENRNPs編輯系統，其次推薦瞬時表達CRISPR/Cas9編輯系統中的TECCRNA方式，而TECCDNA方式因質粒DNA被細胞內源核酸酶分解後的小片段DNA有時會插入靶位點和非靶位點處，如果插入的DNA片段過小，目前的檢測手段還不能對其進行有效鑒定，故不推薦；沒有條件利用DNA-free植物基因組編輯系統的情況下，則使用經典的CRISPR/Cas系統。
三、基因組編輯技術在作物遺傳改良上應用的機遇與挑戰
作物轉基因育種的歷史已有20多年，很多轉基因作物如棉花、大豆、玉米等已在多個國家種植，但轉基因生物(geneticallymodifiedorganism，GMO)的生物安全性問題一直備受關注。基因編輯技術的出現為作物分子育種提供了新的機遇，但仍然面臨政策法規和技術優化兩方面的挑戰。目前，國際上對基因編輯作物是否屬於轉基因生物尚未有明確一致的定論，其監管標準也存在較大爭議。美國農業監管部門認為基因編輯作物(genomeeditedcrop，GEC)是通過細胞自我修復機制而產生的突變體，與作物自然突變以及物理和化學誘導突變極其相似，都是少數幾個核苷酸的改變，因此，GEC不被定義為GMO。歐盟對GMO監管較為嚴格，其認為只要有外源DNA轉入，而不論最終植物中是否還存在外源DNA，都被定義為GMO。從科學角度來講，基因編輯誘導的突變與自然突變以及物理和化學誘導突變性質一樣，實質無法區分，因此歐盟也有建議將GEC定義為非GMO。但基於政治考慮，歐盟尚未下明確定論，對GEC的監管標準存在不確定性。目前，中國對於基因編輯作物的監管標準尚無明確的規定，因此亟需出台相關的政策法規以正確引導基因編輯育種。迄今，美國農業監管部門至少已認定5種基因編輯作物新品種不屬於GMO範疇，即通過ZFNs技術創製的低植酸玉米品種，通過TALEN技術創製的耐冷藏馬鈴薯品種和高油酸、低亞油酸大豆，以及通過CRISPR/Cas9技術創製的抗褐化雙孢菇和抗除草劑玉米。
為正確引導基因編輯技術應用於作物育種，中國科學院的李家洋院士等針對基因編輯作物提出了一個監管框架，並發表在《NatureGenetics》雜誌。文章對基因編輯作物的監管提出了幾點建議：一是在研究階段應盡量減少GEC不受控的傳播風險；二是要確保GEC中外源DNA被完全剔除；三是準確記錄靶點DNA的變化，如果通過同源同組引入了新的序列，必須註明供體和受體之間的親緣關係；四是基於參考基因組信息和全基因組測序技術檢測並確定主要靶點沒有意外的二次編輯事件和考慮潛在脫靶事件的後果；五是將上述四點信息在新品種資料中登記備案，除上述四點外，GEC只需執行常規作物品種的監管標準即可。同期，該雜誌編輯部發文支持GEC管理框架的建議，並倡導GEC品種在完成透明的原則下，不需要進一步的監管，及與傳統品種進行區分。
基因組編輯技術從出現至今不過短短十多年時間，但其已廣泛應用於生物醫學和農業等領域。特別是TALENs和CRISPR/Cas9技術出現後，極大地加快了作物分子育種的研究步伐。目前，CRISPR/Cas技術已成為基因編輯應用的首選，雖然發明至今不到5年時間，但已被廣泛應用於生物和農業的各個領域，而其本身也歷經了多次技術優化。例如，利用Cas9變體將脫靶率降低到檢測不到的水平，對Cas9和Cpf1蛋白進行定點突變擴大了PAM位點的選擇範圍，基於CRISPR/Cas9的植物基因組單鹼基編輯系統，基於CRISPR/Cas9的植物基因組定點插入和替換系統，以及DNA-free植物基因組編輯系統等。
目前，基因編輯技術應用於作物遺傳改良，主要是通過定點突變靶標基因，造成基因功能缺失(loss-of-function)以實現性狀改良，故敲除的基因必須都是目標性狀負調控基因。但作物許多性狀改良都需要獲得基因功能(gain-of-function)，因此，基因組定點替換或插入的基因組編輯具有更廣泛的應用前景，而植物細胞中同源重組效率很低，目前植物基因組編輯技術對基因單鹼基替換、片段定點插入和替換等編輯的效率還很低。如目前已報道的植物單鹼基定點替換技術在水稻、小麥和玉米中的編輯效率為0.39%—20%(大都低於10%)，且只能是CT(GA)鹼基替換；而已報道的植物基因組定點插入和替換技術在水稻、玉米和擬南芥中的編輯效率也極低，片段定點替換效率普遍低於1%。因此，對大部分控制重要農藝性狀的正調控基因目前還無法高效、精準地進行編輯，從而極大地限制了基因編輯技術大規模應用於作物遺傳改良的步伐。
雖然目前基因組編輯技術應用於作物遺傳改良還存在政策法規和技術優化兩方面的挑戰，但在植物基因功能研究和作物遺傳改良上其更具有其他分子技術無法比擬的巨大優勢和機遇。放眼未來，我們預計GEC品種監管的法規肯定會寬鬆；實現基因定點替換和插入的基因組編輯技術一定會得到優化。隨著大量作物品種全基因組測序的完成和越來越多重要農藝性狀不利基因被發現，基因組編輯技術必將在作物遺傳改良和品種培育上發揮巨大的作用。
TAG:基因農業網 |