2 招輕鬆應對投稿時編輯對抗體特異性的質疑

實驗室大師姐是位學霸，這學期結束就要畢業了，她奮起神勇準備發一篇高分的文章，也算是自己學生生涯的完美總結和對自己的交代。經歷了九九八十一天的廢寢忘食實驗後，大師姐信心滿滿的給某 SCI 影響因子分數頗高的雜誌投遞了自己的文章，結果卻收到了雜誌編輯如下的提問回復：

無獨有偶，以 nature 系列雜誌為例，提交論文需要完成 reporting summary 的一系列問題，其中有一個必答問題如下：

9. Antibodies

Describe the antibodies used and how they were validated for use in the system under study （i.e. assay and species）。

類似對抗體驗證（抗體特異性）的質疑不再僅限於 science，nature 等高分雜誌，由於生物試劑普遍存在的特異性問題導致實驗結果不可重複1，已經引起主流學術期刊的關注。編輯們正逐漸提高對抗體特異性問題的重視，並要求提供抗體特異性的證據。

事實上，抗體的特異性問題，就是我們常說的「脫靶」。市面上抗體的品質良莠不齊，有相當一部分抗體並不能正確識別您想研究的靶標。想想是不是有些可怕？！使用這些「脫靶」抗體，如果您的檢測結果為陰性，那就極有可能錯失您苦苦尋覓的信號；如果您的檢測結果為陽性，那麼您的實驗結論則完全不成立，需要推倒重來！！！這要是到了最後投文章的時候才意識到可能的隱患，那情況就相當尷尬了。

目前，縱觀市場上商業化抗體廠商，能夠提供特異性證明的屈指可數。我們常見的 WB 驗證、IHC 驗證、流式驗證事實上僅為應用有效性驗證，並不能排除抗體的非特異性結合。簡單的說，此驗證非編輯所要的「驗證」！那麼到底什麼樣的驗證才是抗體特異性最有效證明呢？

根據 Nature Methods 2016 年的文章2，國際抗體驗證工作小組（International Working Group on Antibody Validation, IWGAV）提出 5 種支柱策略（conceptual pillar），如下：

1. 基因策略（敲除驗證）：利用 CRISPR/Cas 或 RNAi 等技術對靶基因進行敲除（knock out）或敲低（knock down），分別檢測對照組與 KO 組的信號。

2. 正交策略：在多種樣品中使用一種與抗體無關的定量方法，然後比較分析基於抗體的定量方法與抗體無關的定量方法之間的相關性。

3. 獨立抗體策略：使用兩種或多種抗原表位不同的抗體，通過比較和定量分析來驗證抗體的特異性。

4. 標記蛋白表達：在內源靶基因上加入標籤或熒光蛋白。比較分析蛋白標記的信號與基於抗體方法的檢測信號的相關性。

5. 免疫捕獲後進行質譜分析：免疫捕獲（IP）溶液中的靶蛋白，然後進行質譜分析，鑒定與抗體直接作用的蛋白，以及可能與靶蛋白相互作用的蛋白。

在這五種驗證方法中，敲除驗證（knock out validation）是最有力，最為廣泛接受的特異性驗證方法。靶基因被敲除後，目標蛋白不會存在於樣品中，因此成為絕佳的陰性對照。與對照組一起進行對比試驗，抗體是否特異則一目了然。

上圖顯示了對野生型 L2987 細胞（左圖）和 PD-L1 基因敲除 （KO） L2987 細胞系（右圖）使用抗 PD-L1 [28-8] RabMAb抗體（ab205921）的染色情況。利用 TALEN 編輯 L2987 結腸直腸癌細胞系中的 PD-L1 基因，靶向人 PD-L1 的第 4 外顯子。通過深度測序可確認 KO 已完成。記得哦，這才是雜誌編輯想要的特異性證明！

使用經過敲除驗證的抗體來進行靶標的檢測，結果更令人信服。

因此，建議所有抗體使用者在購買抗體時關注特異性數據，以下兩招請務必牢記：

1. 廠商是否提供敲除驗證數據（KO validated），如果有，可以放心使用；

2. 如果沒有此數據，可以查閱相關文獻是否有以上特異性驗證相關的實驗數據，儘可能選擇有驗證數據支持的抗體。

以上第一種情況，可以順利通過編輯審查，如下：

範例回復，來源神經所的 Nature 文章3：

Abcam 已擁有 1,000+ 高品質抗體，通過了業內最嚴格的敲除驗證（KO validation），也是抗體業僅有的 1,000 多個通過「敲除驗證」的高品質商業抗體！

第二種情況，相對複雜，需要引用別人已發表的敲除驗證的數據。

請注意，並不是引用的文獻越多越好，而是要有至少一篇證明抗體特異性的文獻。以下以發表在 Cell Report 上 CFP1 靶點研究文章4為例。

這篇文章研究的是不孕症里的一種卵母細胞不能完成發育的情況，涉及到基因信息的傳遞和表觀遺傳學的機制。其中組蛋白修飾 Histone modifications 是卵母細胞在發育中的關鍵步驟，該研究應用了卵母細胞的 CFP1 條件敲除小鼠來研究早期胚胎髮育中 H3K4me3 的調控作用。

由上圖可見，WB 檢測 GV 期和 MII 期 CFP1 的表達，而敲除後 CFP1 條帶微弱，證明了抗體的特異性。

這就是 editor 要的抗體驗證哦！

如果您也使用了這個抗體，就可以引用這篇文章來作為抗體驗證的證據回復 editor 啦。

為了方便用戶使用 Abcam 高品質抗體，Abcam 舉辦了「KO 文獻有獎反饋」活動，已有 24 篇 Pubmed「KO」文獻等你引用，具體如下：

由於 Abcam 在抗體驗證上的卓越成就，國際抗體行業權威媒體CiteAb今年年初授予了 Abcam「最佳抗體驗證獎」。

參考文獻：

2. UhlenM, Bandrowski A, Carr S, Edwards A, Ellenberg J, Lundberg E, Rimm DL, RodriguezH, Hiltke T, Snyder M, Yamamoto T.A proposal for validation of antibodies. Nat Methods. 2016 Oct;13（10）：823-7. （PMID: 27595404）

3. Yin JA, Gao G, Liu XJ et al. Genetic variation in glia-neuron signalling modulates ageing rate. Nature. 2017 Nov 8;551（7679）：198-203. （PMID: 29120414）

4. Yu C et al. CFP1 Regulates Histone H3K4 Trimethylation and Developmental Potential in Mouse Oocytes. Cell Rep. 2017 Aug 1;20（5）：1161-1172. （PMID: 28768200）

作者：Abcam

圖片來源：Abcam

題圖來源：shutterstock.com 正版圖庫

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