卵巢癌的CAR-T細胞療法已通過體外實驗！
cancer gene therapy
IF：3.652
文章內容
前沿引索
隨著基因編輯技術的逐步發展，過繼性免疫治療在腫瘤生物治療中佔據著越來越重要的作用，成為了繼手術、化療、放療後的新型腫瘤治療方法，這其中以嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾的T細胞靶向性治療各種腫瘤的研究最為突出，在體內和臨床實驗中均表現出對腫瘤細胞良好的靶向殺傷性，展示了巨大的應用潛力和發展前景。
整合素αvβ6在腫瘤的發生髮展過程中發揮極為重要的作用，在卵巢癌、胰腺癌、口腔鱗狀癌中表達也已得到證實，且與卵巢癌的轉移相關，可促進腫瘤侵襲及轉移，是研究卵巢癌的重要靶點。
邏輯思路
Bpep-CAR-T細胞模型驗證
Bpep-CAR的構建
T細胞特異性及殺傷性檢測
方法剖析
1.Bpep-CAR的構建（圖一）
通過噬菌體展示肽庫篩選的方法得到靶向αvβ6抗原特異性的CAR（Bpep-CAR），下圖分別展示的是該嵌合抗原受體的氨基酸序列、重組質粒圖譜及三維立體構象圖。
圖一 Bpep-CAR的構建
2.體外轉染至T細胞並驗證（圖二）
Bpep-CAR電轉至PBMCs，篩選後得到含有Bpep-CAR的細胞毒性T淋巴細胞（CTL），WB檢測結果顯示（a）本文中所構建的CAR-T細胞均呈現pep-CAR和CD3ζ陽性條帶。
流式檢測Bpep-CAR是否會在細胞表面表達，同時檢測T細胞的表面標誌因子TCR、CD3、CD4（輔助性T細胞表面標誌因子）和CD8（殺傷性T細胞表面標誌因子），結果顯示（b）Bpep-CAR成功在CTL細胞中進行表達；TCR、CD3和CD8陽性結果明顯，證明了本文中的Bpep-CAR+CTL為殺傷性T細胞。
圖二
體外轉染至T細胞並驗證
3.各細胞系中αvβ6的表達水平（圖三）
流式檢測卵巢癌細胞OVCAR-3、RSN001、RSN002和淋巴瘤細胞Daudi、SUP-B15中αvβ6的表達水平；結果顯示卵巢癌細胞中均有表達，而淋巴瘤細胞中表達不明顯。
圖三
各細胞中avβ6的表達水平
4.Bpep-CAR+TCL的特異性殺傷性檢測（圖四）
鉻釋放試驗檢測Bpep-CAR+ T細胞對卵巢癌細胞的殺傷性作用，結果顯示Bpep-CAR+T細胞可以特異性殺死高表達αvβ6抗原的卵巢癌細胞（OVCAR-3、RSN001、RSN002），並呈濃度依賴性；同樣對於前期構建的CD19特異性CAR-T可以特異性殺死高表達CD19的SUP-B15細胞，而對CD19陰性的OVCAR-3沒有效果。
圖四
Bpep-CAR+TCL的特異性殺傷性檢測
5.Bpep-CAR+T細胞腫瘤抗原結合特異性檢測（圖五）
通過體外刺激試驗：效應T細胞與目的腫瘤細胞共培養，結果發現OVCAR-3（αvβ6+）卵巢癌細胞培養組產生的IFN-γ是Daudi細胞（αvβ6-）培養組的10倍；當αvβ6被抑制後，IFN-γ的產生隨之減少；由此可見本文中做構建的特異性識別αvβ6抗原的Bpep-CAR T細胞療法確證是通過作用於αvβ6靶抗原而發揮抗腫瘤細胞的作用。
圖五
Bpep-CAR+T細胞腫瘤抗原結合特異性檢測
總結/思維發散
總結
本研究旨在構建靶向卵巢癌細胞抗原αvβ6的嵌合抗原受體T細胞，它可以被表達αvβ6抗原的腫瘤細胞激活並殺死腫瘤細胞，且特異性強，幾乎不存在交叉反應。
但是僅通過體外細胞試驗證明了CAR-T細胞療法可特異性殺死表達αvβ6抗原的卵巢癌細胞是不夠的，還缺乏體內實驗數據。
思維發散
可在此基礎上採用藥物誘導或注射αvβ6表達陽性的腫瘤細胞（OVCAR-3）皮下成瘤的方法構建小鼠卵巢癌模型，進而使用文中的獲得的特異性殺傷腫瘤細胞的Bpep-CAR+ T細胞對卵巢癌小鼠模型進行治療，真正意義上實現卵巢癌的CAR-T細胞療法，獲得更多的體內治療數據，對卵巢癌臨床治療提供更有力的數據支持。
參考文獻
[1] Li K,Lan Y,Wang J,Liu L,. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for liver cancers, progress and obstacles. Tumour Biol 2017; 39(3)
[2]Ahmed N, Riley C, Rice GE, Quinn MA, Baker MS.Alpha(v)beta(6) integrin-A marker for the malignant potential of epithelial ovarian cancer. J HistochemCytochem 2002;50: 1371–1380.
[3]Niu J, Gu X, Ahmed N, Andrews S, Turton J, Bates R et al.The alphaVbeta6 integrin regulates its own expression withcell crowding: implications for tumour progression. Int J Cancer 2001; 92: 40–48.
TAG:卵巢 |