《Cell》子刊：優化Cas9特異性新思路！

新聞 01-22

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crispr/cas9技術

導讀

科學家們通常利用RNA引導Cas9核酸酶在多種細胞（包括iPS）的特定的基因組位點上進行切割、修飾。但是，Cas9的脫靶效應嚴重阻礙了其應用。然而最近的一項研究揭示了HNH核酸酶結構域與PAM遠端的RNA / DNA異源雙鏈體之間的遠程變構通訊，並以此作為校對檢查點來控制Cas9的核酸酶活性和特異性。

研究者應用單分子FRET（smFRET）來直接表徵個別化膿鏈球菌Cas9的構象動力學。研究表明，Cas9自發波動於三個構象狀態之間，其伴隨著顯著的催化HNH域的運動。此外，研究者通過引入sgRNA與靶DNA鏈之間的錯配，靶與非靶DNA鏈之間的錯配以及Cas9殘基上的突變來檢查Cas9的動態如何受到影響。

研究結果表明，Cas9通過PAM-遠端與其催化HNH結構域之間的長程變構通訊使用校對機制。在PAM遠端的幾個Cas9殘基和RNA / DNA異源雙鏈之間的相互作用觸發Cas9以短暫地取樣其「切割有能力」的閉合狀態以介導DNA切割，而sgRNA和DNA之間的4個或更多個不匹配導致HNH結構域和暫時形成的「裂解受損」閉合狀態。

該研究結果提供了了解Cas9的構象動力學和Cas9與RNA / DNA異源雙鏈之間的相互作用如何決定其核酸酶活性和靶特異性的基本分子概述。最後，研究者提出一個替通過突變參與校對步驟的殘基來提高Cas9特異性的替代方法。

1.Cas-9動態行為

Cas9介導的DNA識別和切割是高度動態的多步驟過程，包括sgRNA結合、目標搜索、RNA鏈入侵、R環擴增和DNA切割。本研究的主要焦點是Cas9的構象動力學如何在Cas9穩定結合於DNA靶點後對其進行DNA切割。

Cas9的幾種不同的結構構象已經通過結構研究而被觀察到。在這裡，研究者直接捕獲了Cas9在三個主要全局構象狀態之間自發轉換，即使它結合完全互補的靶DNA，這反映了催化性HNH結構域的顯著動態運動。高速原子力顯微鏡（AFM）也可以實時觀察Cas9與DNA結合後HNH結構域的波動情況。該研究結果表明，HNH結構域的局部構象可以通過遠距離變構通訊在PAM遠端形成sgRNA / DNA異源雙鏈進一步調節。

另外，之前的smFRET研究已經揭示，完全匹配的sgRNA / DNA異源雙鏈體在其PAMdistal末端也自發地在壓縮和解鏈構象之間轉換，其提供了這種構象靈活性，這提供了HNH結構域的局部構象靈活性更直接的證據表明Cas9 / sgRNA / DNA複合物採用兩個或多個動態構象狀態而不是穩定的靜態結構。

總之，這些結果毫無疑義地證明了整體水平和局部上的Cas9 / sgRNA / DNA複合物的高度構象動態性質。

Cas9治理DNA裂解的構象動力學

2.Cas-9高保真機制

在所有情況下，Cas9的封閉構象狀態最少。在催化位點朝向其靶位點的正確位置上的短暫停留在裂解能夠閉合的狀態下，這足以使Cas9切割其靶DNA鏈。類似的分子行為已經被發現並被認為是在延伸和DNA複製的氨醯-tRNA選擇期間達到高保真度的分子機制，在此期間核糖體/氨醯基tRNA /延伸因子Tu複合物和DNA聚合酶已經顯示出分別在非活性狀態和活性狀態之間波動。研究提示Cas9採用類似的分子機制來實現其高特異性。有裂解能力的閉合狀態的穩定性已經發展成不如其他非活性狀態穩定。

因此，只有正確的DNA靶標才能瞬間引發朝著能夠切割的狀態採樣以完成切割，而含有錯配的DNA目標不太可能或者完全不能導致這種瞬時採樣。 Cas9和DNA之間相互作用減弱或加強的事實導致Cas9特異性增強或降低，同時伴隨分裂能力狀態的減少或增加。總之，非活性狀態和活性狀態之間的良好構象動力學是Cas9實現其高特異性的基本分子機制。

3.Cas-9的校對機制

Cas9的全局結構構象是高度動態的，並且在三個主要構象狀態之間自發地波動，主要反映開放，中間和封閉狀態中HNH結構域的構象動力學。由於HNH結構域和PAM遠端區域之間的長程變構通訊，含有3個或更少錯配的RNA / DNA異源雙鏈體觸發HNH結構域的局部運動，以正確定位其催化位點以形成能切割的封閉Cas9狀態，而4個或更多個錯配導致HNH結構域的相似但不正確的局部位置，導致裂解受損的封閉的Cas9狀態。

研究者推測Cas9呈現獨特的校對機制以確保sgRNA和DNA之間的互補性，通過感測壓縮的異源雙鏈體（3個或更少的錯配）在PAM上的Cas9結合後通過PAM識別和異源雙鏈形成鄰近PAM。 Cas9的REC3和RuvC-III結構域與PAM遠端的拉鏈異源雙鏈之間的相互作用允許Cas9通過校對步驟（最後一個檢查點），觸發短暫形成有切割能力的閉合狀態，並允許DNA切割。

結果還表明，REC3域參與感知異源雙鏈體形成，並且在校對期間REC2域介導REC3和HNH域之間的長程變構通訊。可以通過修改參與校正步驟的REC3和RuvC-III結構域中的殘基來設計具有增強的特異性的新Cas9變體，特別是對於PAM-遠端。可以通過減弱相互作用來創建幾個高保真性變體REC3和異源雙鏈之間。總之，此研究結果表明，Cas9的多個層次的全局和局部構象動力學相互作用來控制其核酸酶活性和特異性。

參考文獻：

Mengyi Yang, Sijia Peng, Ruirui Sun,Jingdi Lin, Nan Wang, Chunlai Chen. The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET.

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.048

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