環狀RNA在肺癌研究中的進展
摘要
肺癌（lung cancer）的發病率及死亡率在我國雙居首位，近年來針對腫瘤驅動基因和免疫檢查點的靶點治療取得了振奮人心的成果。環狀RNA（circular RNA, circRNA）是一類具有環形結構的RNA分子，研究發現其與腫瘤的分期、淋巴結轉移等關係密切，在生理過程和疾病中具有特殊的生物學功能。其高度穩定性和特異性使之有望成為腫瘤潛在的預測和治療靶點。目前環狀RNA在肺癌中的生物學功能和調控機制僅有少量研究報道。本文對環狀RNA的研究歷史、生源機制、生物學功能以及其在腫瘤，尤其是肺癌研究中的進展作一綜述，以期為環狀RNA在肺癌中的研究提供理論依據和新的思路。
據全國腫瘤登記中心估計，2015年中國癌症總發病約429萬例，總死亡約281萬例，其中肺癌是最常見的癌種，在我國的發病率和死亡率雙居首位 [1] 。大多數的肺癌患者在確診時已有轉移，五年生存率極低，僅約16%。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）在肺癌中最為常見，約佔總數的80%-85%。傳統的手術和放化療治療對晚期肺癌都收效甚微，近十餘年間，針對肺癌驅動基因和免疫檢查點的靶點治療異軍突起。靶向EGFR、ALK、KRAS等驅動基因和PD-1、PD-L1、CTLA-4等免疫檢查點的靶點抑製劑，在晚期肺癌的臨床試驗中效果顯著 [2] 。儘管如此，繼發性耐葯等問題迫使人們不斷找尋新的治療方法。當務之急，深入的機制研究以及新的靶點發現乃是癌症研究的主旋律。隨著高通量測序的發展和演算法的不斷更新，大量非編碼RNA被發現在人體中執行多種生物學功能，參與了腫瘤等多種疾病的發生髮展過程 [3] 。不同於線性RNA（linearRNA），環狀RNA是一類不具有5』和3』末端頭尾結構，以共價鍵形成環狀結構的RNA分子。研究發現環狀RNA不易被核酸外切酶RNase R降解，半衰期達到48h以上，使得其能穩定存在於真核細胞細胞質中，且具有高度保守性和組織、時序、疾病特異性，從而有望成為潛在的腫瘤診斷標誌物和治療靶點 [4] 。
1 環狀RNA簡介
1.1 研究歷史
早在19世紀70年代，研究者們通過電子顯微鏡等手段在病毒中觀察到單鏈、閉合、環狀結構的RNA分子 [5] ，1979年，美國洛克菲勒大學的Hsu和Coca-Prados M [6]在HeLa細胞細胞質中觀察到1%-2%的RNA具有環狀結構，首次證實真核細胞中環狀RNA的存在。在很長的時間裡，由於其發現偶然且檢測到的表達水平極低，環狀RNA被當作無功能的非特異性的轉錄垃圾而躋身角落。2012年，Salzman等 [7] 利用RNA-Seq技術在兒童急性淋巴細胞白血病患者骨髓、Hela細胞以及人胚胎幹細胞（H9）中檢測到大量表達頗豐的環狀轉錄RNA分子，由此證實了在人類胚胎幹細胞和惡性組織細胞中均廣泛存在環狀RNA。隨後成千上萬的環狀RNA被發現，已證實在人類各細胞類型（hg19）、黑腹果蠅（dm3）等生物體中均廣泛存在大量環狀RNA，引發了新一輪的研究熱潮。
1.2 生源機制
早期研究者們對於環狀RNA的認識源於偶然發現的「Scrambled Exon」 [8] ，提示環狀RNA的來源與基因外顯子有著密切的聯繫。後續的研究表明除大部分的環狀RNA由外顯子構成，內含子也大量參與了形成 [9] 。人們對環狀RNA的生源機制尚不明確，研究表明單個基因位點可以通過非經典可變反向剪接（alternative back-splicingjunctions）及經典可變剪接（alternative splice junctions）產生多種類型的環狀RNA [10] 。2013年，Jeck等 [4] 提出外顯子環化形成環狀RNA的兩種模型，一種是「套索驅動環化」（lariat-driven circularization），即基因外顯子共價結合構成環化；另一種是「內含子配對驅動環化」（intron-pair-drivencircularization），即兩個內含子互補配對形成環狀結構。隨後兩種模型皆由剪接體剪切剩餘內含子形成環狀RNA。2014年，Zhang等 [11] 利用全基因組分析和重構circRNA證實了除了ALU重複序列可以介導外顯子環化外，內含子的互補序列也能發揮此功能。2015年，Ivanov [12] 及其團隊同樣證實了這一機制。另外，研究表明RNA結合蛋白Quaking能夠在上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）過程中結合前體mRNA（pre-mRNA）的特定位點，促進環狀RNA的形成 [13] 。結合現有研究，根據環狀RNA成環方式不同將環狀RNA分為以下幾類（圖1A）：外顯子反向剪接成環（exonic circRNA, ecircRNA） [10] 、保留內含子的轉錄本反向剪接（exon-intron circRNA, EIcircRNA）[14] 、內含子反向互補配對（circular intronic RNA, ciRNA）[15] 。研究還發現前體tRNA能剪切成環形成tricRNA（tRNA introniccircRNA） [16] 。此外，研究人員以白血病中的PML/RARα基因為研究對象，在其染色體易位上發現了2個融合環狀RNA（fusion circRNAs, f-circRNA），體內試驗表明融合環狀RNA能促進細胞轉化和腫瘤生長 [17] 。總之，環狀RNA的生源機制有待進一步探索並加以明確。
1.3 生物學功能
1.3.1 MicroRNA海綿MicroRNA（miRNA）是一類線性的非編碼RNA，為基因表達的重要轉錄後調控因子，能夠競爭性結合靶mRNA並促進其降解（圖1B）等，影響生理以至疾病的方方面面。2013年，Hansen等 [18] 在人和小鼠大腦中鑒定出環狀RNA分子ciRS-7/CDR1as能夠顯著抑制miR-7的表達，進一步研究發現ciRS-7上包含了70多個miR-7的特異保守結合位點；同時在小鼠睾丸中發現環狀RNA Sry擁有10多個miR-138的結合位點，並能特異調控mir-138的表達，證實了環狀RNA能夠結合靶MicroRNA調控其表達的功能，推翻了環狀RNA作為無功能轉錄垃圾的觀點，拉開了功能研究的序幕。Memczak等 [19] 同樣證實了ciRS-7/CDR1as的MicroRNA海綿作用，證明CDR1as是miRNA的天然拮抗劑，它與miRNA的結合力是其他轉錄產物的10倍。同時，Zheng及其團隊 [20] 研究發現circHIPK3有9個miRNA的多個結合位點，表明環狀RNA的海綿作用可以同時針對多個miRNA。但目前僅有少數的環狀RNA已驗證具有miRNA海綿作用。環狀RNA作為天然的競爭性內源性RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA），有望替代抗核苷酸化學藥物，調控miRNA的水平，以期調節上下游基因網路，對人類生理和疾病產生影響 [21] 。
1.3.2 RNA蛋白複合物在ceRNA的競爭網路中，大量研究證實環狀RNA和蛋白分別能與miRNA競爭性結合，但環狀RNA與蛋白的結合卻少有發現。德國的Albrecht Bindereif教授及其團隊 [22] 通過甘油密度梯度離心實驗觀察沉降係數的分布，初步得到環狀RNA與蛋白結合的線索證據。隨後鑒定出12種能夠同RNA結合蛋白（RNA-binding protein,RBP）IMP3結合的環狀RNA分子，證實環狀RNA能和蛋白結合形成RNA蛋白複合物。Holdt等 [23] 發現circANRIL能與PES1蛋白結合，介導動脈粥樣硬化。隨後的研究也證實了一些環狀RNA可以結合蛋白產生生物學效應。
1.3.3 轉錄翻譯一直以來環狀RNA被當作非編碼RNA的一類，既往的研究並沒有發現環狀RNA在真核細胞內存在翻譯活動。而最新的研究表現，環狀RNA中含有豐富的m6A甲基化修飾。YTHDF3是m6A的識別蛋白，能夠與環狀RNA的修飾位點結合，並募集eIF4G2和其他翻譯起始因子，從而啟動環狀RNA的翻譯 [24] 。Pamudurti等 [25] 在果蠅的大腦組織中通過核糖體印記分析鑒定出circMBL的終止密碼子處有核糖體結合，並通過蛋白質譜分析得到了環狀RNA翻譯蛋白的直接證據。這使得環狀RNA或許有可能成為新的一類信使RNA分子。
1.3.4 其他功能環狀RNA還能調節基因轉錄 [14] ，作為pre-mRNA的剪接調節器影響蛋白質的合成 [26] 。然而其生物學功能研究仍處於起步階段，需要更深入的研究加以闡釋。
圖一
2 環狀RNA與腫瘤
環狀RNA廣泛參與了生理和疾病的發生髮展過程，在心血管系統、消化道系統、血液循環系統和神經系統等疾病中均發揮著重要作用，在胚胎、外泌體中也有豐富的表達，在腫瘤方面亦如此。研究發現環狀RNA大多以MicroRNA海綿的身份在腫瘤的發生髮展中發揮作用[27] （圖2 [28-59] ）。其中CDR1as（ciRS-7）、circ-HIPK3等環狀RNA在多種類型的腫瘤組織以及非腫瘤性疾病中均有豐富表達，相應的功能機制研究受到了廣泛的關注。
圖二
2.1 CDR1as
小腦變性相關蛋白1反義轉錄產物CDR1as是最早發現具有MicroRNA海綿功能的環狀RNA。CDR1as結合miR-7的經典組合已證實在神經退行性疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化中發揮重要調控作用 [60] 。研究表明CDR1as/miR-7在結直腸癌、肝癌等腫瘤中調控其生物學行為。既往研究已揭示miR-7可以直接作用於腫瘤相關信號通路中的重要蛋白，如腦膠質瘤中miR-7/EGFR和PKB/IRS-1和IRS-2通路，乳腺癌中miR-7/Pak1和HOXD10通路和在肝癌中的miR-7/PI3K和Akt通路等，提示CDR1as可通過miR-7海綿間接調控miR-7相關通道 [61] ，影響腫瘤的生物學行為。
2.2 circHIPK3環狀RNA分子
circHIPK3在多種類型的腫瘤和正常組織中差異表達明顯。研究人員發現circHIPK3可以結合多種MicroRNA發揮生物學效應：ircHIPK3/miR-124在人體細胞中調控其生物學活動；ircHIPK3/miR-30a/表皮生長因子EGFC、FZD4和WNT2在糖尿病視網膜血管功能障礙中具有重要作用 [62] ；circHIPK3/miR-558/HPSE在膀胱癌中調控其遷移、侵襲和血管生成 [52] 。
3 環狀RNA與肺癌
前人通過高通量測序已經在肺癌組織和細胞系中發現了成千上萬的環狀RNA，但其在肺癌中的具體功能和作用機制卻少有研究。總體而言，已有的環狀RNA在肺癌中的研究大致可分為生物標誌物研究和功能機制研究。
3.1 生物標誌物
Yao等 [63] 發現在NSCLC中circRNA-100876高表達與肺癌的淋巴結轉移和腫瘤分期的關係密切，且circRNA 100876高表達的NSCLC患者的總體生存時間明顯縮短。Zhu等 [64] 利用基因晶元在肺腺癌中篩選出具有差異表達的環狀RNA，其中hsa_circ_0013958在組織細胞、血漿中均顯著上調，且與淋巴結轉移和腫瘤分期具有統計學意義。Zhao等 [65] 對4例非吸煙型早期肺腺癌的腫瘤組織和癌旁組織進行高通量測序，找到300多個在腫瘤組織中差異表達的環狀RNA，並通過RT-qPCR驗證了其中的5個，結果與晶元結果相符，為早期肺腺癌的診斷和治療研究提供了潛在的靶點。Luo等 [66] 研究注意到hsa_circ_0000064在肺癌組織及肺癌細胞系A549和H1229中表達上調，其異常表達與腫瘤淋巴結轉移和TNM分期等臨床特徵密切相關。
3.2 功能機制
Jin等 [67] 對肺癌病例和健康對照組的血液樣本進行RNA測序，檢測了miRNA、circRNA和mRNA以及長非編碼rna（lncRNA），通過通路富集分析，建立了以MiRNA為目標的內源性競爭網路，篩選重要節點進行生物信息學預測，構建了轉錄因子調控網路。Hansen等[68] 研究發現CDR1as能通過結合miR-7發揮對腫瘤的抑制作用，在肺癌中亦如此。Wan等 [69] 對78例肺癌患者的癌組織和癌旁組織進行了circ-ITCH的檢測，結果顯示circ-ITCH在肺癌中表達明顯減少。在細胞實驗中，circ-ITCH異常表達可以顯著影響其親代癌抑制基因ITCH的表達，抑制肺癌細胞增殖。進一步實驗表明circ-ITCH可充當miR-7和mir-214海綿，增強ITCH基因的表達，從而抑制Wnt/β-Catenin信號通路的激活。田芳 [70] 及其團隊在NSCLC細胞系H1299、H827、H1975、H2170、H520、H1650中均檢測到circ-HIPK3的表達，且NCI-H2170表達量最高，NCI-H1299表達量最低。實驗表明在NCI-H1299和NCI-H2170中，circHIPK3能結合miR-379調控類胰島素樣生長因子IGF1的表達水平，促進細胞增殖。利用肉桂醛干預抑制Wnt/β-Catenin信號通路，發現hsa_circ_0043256顯著下調，並能夠作為miR-1252海綿削弱肉桂醛的抑制作用。進一步研究發現ITCH基因表達與hsa_circ_0043256成正相關，提出了肉桂醛干預NSCLChsa_circ_0043256/ miR-1252/ITCH軸的作用新機制 [71] 。Zhu等 [64] 研究表明hsa_circ_0013958能與miR-134結合調控細胞周期蛋白D1（cyclin D1）的表達。
3.3 啟示
迄今為止，越來越多的實驗證據證實環狀RNA具有穩定特性和組織、時序、疾病特異性，這使得環狀RNA相較於miRNA似乎更具有生物標誌物和治療靶點價值。從已有的關於肺癌中的環狀RNA來看，首先，由於高通量測序成本代價高，已有研究用於測序的樣本量較少，而後續試驗驗證所用總體樣本量雖然基本可以達到統計學要求，但是具體到肺癌各組織分型的標本數據明顯欠缺，使得橫向比對各組織分型中的環狀RNA的數據明顯缺失或者不可靠；肺癌發生髮展時間軸（正常-癌前病變-早期-晚期肺癌）縱向比對環狀RNA表達差異和機制研究由於診斷和取材等限制難以實現。期待隨著高通量技術的不斷成熟、成本的降低以及演算法的不斷完善，大範圍大樣本的肺癌環狀RNA研究能成為現實。其次，研究發現環狀RNA在人體血漿、外泌體等也廣泛存在，而現有的肺癌環狀RNA研究利用的標本種類過於單一，對於肺癌循環血漿及外泌體等的環狀RNA研究少有涉及，不同標本類型間的差異研究更屬罕見。再者，環狀RNA分子具有多種重要的生物學功能，且目前為止僅有少量的環狀RNA經驗證具有MicroRNA海綿功能。此外現有肺癌環狀RNA研究幾乎都致力於研究一個新的環狀RNA分子的MicroRNA海綿功能，使得有關研究雷同而不夠全面、不夠深入。ceRNA內源性競爭機制的複雜調控網路亟需納入更多的因子（如mRNA、蛋白等）來豐富和完善。此外，集中對CDR1as、circHIPK3等明星環狀RNA分子的更深層次機制和功能的挖掘有助於我們更深刻地了解環狀RNA的特性。最後，環狀RNA性質穩定，半衰期較長且不易降解的特性賦予了針對環狀RNA進行RNA藥物研發的可行性；環狀RNA內源性競爭機製為替代抗核苷酸化學治療的研究提供了理論基礎。目前環狀RNA的研究尚處於起步階段，功能和機制研究尚不明確，基於環狀RNA的RNA藥物研發任重而道遠。
4 展望
靶點治療已成為癌症治療研究的新寵。肺癌作為我國發病率和死亡率雙居首位的癌種，儘管EGFR、PD-L1等靶點治療在臨床試驗中大放光彩，但是我們也必須看清局限的治療目標和緩解率以及繼發性耐葯等問題迫使我們不能忽視對肺癌的基礎研究，還需尋找新的預測、診斷和治療靶點。環狀RNA在真核細胞細胞質中廣泛存在，相對於線性的RNA具有高度穩定特性和組織、時序、疾病特異性，在腫瘤中發揮著一系列生物學功能，使其具備作為腫瘤預測、診斷和治療靶點的潛能。但環狀RNA的研究尚處於起步階段，其機制及生物學功能尚不明確，在肺癌中的研究更是屈指可數，有待更多更深層次的研究來闡明。在肺癌的環狀RNA研究中，我們還需橫向擴大各組織病理分型的樣本數量和樣本類型以比較不同肺癌分型和樣本類型的環狀RNA差異，或者縱向延伸肺癌發生髮展時間軸以比較肺癌發生髮展中的環狀RNA差異。實現這些目標，需要強大的人力、物力、財力的支撐，相信隨著高通量測序技術的完善和成本的降低，以及演算法的不斷完善，勢必會準確預測出更多的環狀RNA分子，實現大規模大樣本的環狀RNA研究，為探索肺癌的生物學標誌物以及後續的功能研究打下基礎；環狀RNA在肺癌中的功能機制研究也不會僅僅局限於MiRNA海綿，而是在ceRNA內源性競爭機制的海洋里大放異彩，奠定內源性競爭機制替代抗核苷酸化學治療的基礎。RNA藥物治療腫瘤從基礎走向臨床或將成為必然。總而言之，環狀RNA是一類新興的有望成為腫瘤潛在的預測、診斷和治療靶點的RNA分子，具有極高的研究潛能和價值。
[成星宇, 申洪. 華南理工大學醫學院.環狀RNA在肺癌研究中的進展. 中國肺癌雜誌, 2018, 21(1): 50-56.]
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