中國科學家取得重大突破，世界首例SCNT克隆短尾猴誕生！

自1996年克隆羊多莉誕生以來，克隆技術一直是社會關注的重點。尤其是靈長類的克隆技術，這對於人類的自我研究起到了至關重要的作用，但是這項技術也異常的難實現。《Science》在2003年更是發表了一篇美國匹茲堡大學醫學院的論文，稱用現有技術克隆靈長類動物是行不通的。

7年後，也就是2010年，美國俄勒岡靈長類研究中心的著名科學家米塔利波夫率領團隊成功移植了克隆猴胚胎，但胚胎髮育至81天就以流產告終。

圖丨由中國科學家創造的SCNT克隆短尾母猴「中中」和「華華」

然而這項「行不通」的技術卻被中科院上海神經科學研究所孫強、蒲慕明領導的研究團隊打破了，該團隊於2017年11月27日利用體細胞核移植技術（SCNT），創造了短尾猴「中中」，並於10天後創造了短尾猴「華華」。至此，世界上首隻體細胞克隆猴誕生了，而這項研究則在2018年1月25日登上了《Cell》期刊。

如何創造克隆猴？

體細胞克隆猴有三大技術難點：細胞核不易識別，「去核」難度大；卵細胞容易提前激活；體細胞克隆胚胎的發育效率低。

於是該團隊首先優化了SCNT方案，包括從卵母細胞中去除紡錘體。致使胎兒猴的成纖維細胞與去核卵母細胞融合後檢測到明顯的紡錘樣結構。融合後約1 - 2小時，用離子黴素和6-二甲基氨基嘌呤（I/D）活化重建卵母細胞。所有活化的胚胎顯示單原核。

進一步將I/D激活的SCNT胚胎的一小部分（13.8％）發育至胚泡階段。在I/D激活組之後，為了提高SCNT胚胎的發育潛力，該團隊還花費了10個小時的時間，用10納米蛋白脫乙醯酶抑製劑曲古抑菌素A（TSA）來製作了另一組SCNT胚胎（I/D/T）。

這樣的做法雖然不能提高囊胚率（16.7％），但是囊胚的質量得到了改善。在I/D激活組中，內細胞團（ICM）很少，甚至沒有。然而在I/D/T組中，其2/5的囊胚中都能觀察到明顯的ICM。

圖丨將核供體細胞與血凝素病毒分離出的病毒包膜共同孵育，並促進供體細胞插入透明帶的激光損傷的卵周隙

隨後，研究團隊將外源性人類Kdm4d mRNA注射到I/D/T激活的SCNT胚胎中，大約45%的胎兒猴成纖維細胞能夠發育成囊胚。而剩下的那些胚胎，則表現出類似於向囊胚內注射精子後所獲得的ICM。

研究團隊還測試了Kdm4d mRNA對來自成年雌性猴子卵母細胞SCNT胚胎的作用，並且發現在I/D/T條件下所有SCNT胚胎在激活後都顯示出單個原核。同時大部分能夠發育成囊胚。且均能觀察到明顯的ICM。相反，在沒有Kdm4d mRNA注射的情況下，只有5％的SCNT胚胎（來自卵母細胞）能夠發育成胚泡，而且沒一個有明顯的ICM。

為了進一步了解Kdm4d mRNA對改善猴SCNT胚胎髮育的影響，研究團隊通過ICSI技術從卵母細胞中獲得了4-細胞胚胎、注射了Kdm4d mRNA的8-細胞胚胎，以及沒有注射Kdm4d mRNA的8-細胞胚胎，並對三者進行了RNA測序。

其結果是，8-細胞胚胎和4-細胞胚胎在3997個區域中，前者的表達量高了後者四倍，而注射過Kdm4d mRNA的細胞胚胎的RRR為2178，沒注射過的為2465。通過H3K9me3的免疫染色進一步證實了Kdm4d mRNA表達在去除SCNT胚胎的組蛋白甲基化位點H3K9me3中的作用：SCNT胚胎中H3K9me3的水平高，注射Kdm4d mRNA後就會降低。

圖丨簡化版

兩組實驗取得了不同的結果：在第一組實驗中，21隻代孕母猴中的6隻成功懷孕，最終生下了2隻健康的猴子，它們就是「中中」和「華華」；另一組研究，42隻代孕母猴中有22隻成功懷孕，最後也有兩隻猴子出生，然而它們短暫存活後死亡。

研究的意義

這項克隆猴技術的研究簡單點來說就是使用胎兒成纖維細胞的體細胞核轉移（SCNT）克隆兩隻猴子，但是其科學意義遠不止於此。

圖丨科幻作品中的克隆人

首先，研究揭示了遺傳調節劑對SCNT胚胎的發育和妊娠率的影響。H3K9me3去甲基化酶Kdm4d mRNA的注射和組蛋白去乙醯化酶抑製劑曲古抑菌素A在SCNT後一個細胞階段的處理極大地提高了SCNT胚胎的囊胚發育和妊娠率。

其次是用卵母細胞創造SCNT克隆猴來推翻此前「行不通」的言論。卵母細胞是核供體細胞重編程的場所，為克隆胚胎髮育提供了充足的物質基礎，它的來源以及成熟質量直接影響到克隆效率的高低。

近年來，為提高卵母細胞與克隆胚胎的質量，研究人員進行了大量的嘗試。有研究表明，在克隆豬胚胎的培養中添加一定劑量的維生素C可以顯著提高克隆胚的質量，一些幹細胞因子（Oct4、Klfl4、Sox2）的mRNA表達量明顯上升，其表達量可達到IVF胚胎水平，使用維他命C處理過的胚胎進行胚移後，其產仔率明顯升高。使用CBHA（一種去組蛋白乙醯化抑製劑）處理小鼠的克隆胚胎後，胚胎克隆效率明顯提高，並且還源於克隆胚胎的幹細胞質量也明顯提升。因此，克隆猴研究的結果，也延伸了克隆技術中卵母細胞的應用。

圖丨由假說到落地，克隆綿羊多莉的誕生

其三則是證實了SCNT猴的克隆起源假說。

對SCNT的意義更重大

雖然這是人類首次克隆非人類的靈長類動物，但是SCNT技術早在1997年就已經實現了動物的克隆（多莉）。目前來看，該技術更多的被應用於氂牛、種豬等功能性家畜的培育，因為這類家畜在種群中出現的幾率極低，所以光靠人工培養是遠不能滿足需求的。

圖丨簡易版SCNT

不過該領域並沒有成熟的SCNT技術落地，仍停留在理論階段。湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所曾於2017年發表了一篇論文，解釋了從受體卵細胞的準備、供體細胞的選擇到核移植技術、重構胚胎等幾大SCNT培育種豬的步驟。然而論文結尾處作者表示對該技術並不樂觀，因為其克隆效率低、克隆動物細胞存在突變可能等。

事實上孫強、蒲慕明的研究也不能完全改善這一現狀，但是這項研究給了SCNT另一種擴展思路：頑疾研究。單論靈長類這一點，人類與猴子在某種程度上是親戚。所以，克隆猴技術的誕生，變相地打開了一條阿爾茨海默症、自閉症等腦疾病以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病治療方法的研究之路。

圖丨克隆猴Tetra

2000年，俄勒岡靈長類動物研究中心利用胚胎分裂法（embryo splitting）克隆了獼猴Tetra。這種克隆方法不同於SCNT，而是把多個猴胚胎（107個）進行分裂，然後對胚胎進行移植。結果有4個能夠發育，最終僅有一隻名為Tetra在胚胎分裂157天之後幸運地降生。不過這項技術的難度沒法和SCNT比較，因此該研究成果並沒有獲得科學界的廣泛關注。

SCNT還需要解決哪些問題？

接著DT君在上文提到的體細胞克隆成功率問題繼續說，目前公認的體細胞克隆成功率在1%～3%。克隆胚胎移植後的出生率平均不10%。表觀遺傳修飾異常應該是體細胞核轉移後供體細胞核在細胞質中可逆分化效率低的原因之一。胎兒異常、流產和圍產期死亡率高，出生後一周的死亡率最高可達100%。

其次，無論直接注射還是細胞融合，供體核都帶入一部分細胞質。於是，就出現了移核胚胎的線粒體來源問題。多莉和另外9隻經細胞融合產生的克隆綿羊的mtDNA 完全來源於受體胞質。Meirelles證明，瘤牛（Bos indicus）克隆後代的線粒體完全來源於黃牛（Bos taurus）卵母細胞質。但Steinborn等卻發現，克隆牛的線粒體為雜合型，既有來自於供核細胞的，也有來自於受體胞質的。因此，核移植克隆動物實際上是一種遺傳嵌合體-nDNA 來源於核供體細胞，而mtDNA則至少部分來自受體胞質。

圖丨克隆羊

其三，端粒是染色體端部特化部分，因無黏性而能防止染色體黏著。端粒由高度重複的短序列核苷酸組成，具有高度保守性。細胞每複製一次端粒核苷酸就減少50～100bp。端粒複製要靠端粒酶。正常細胞缺乏此酶，故端粒隨細胞分裂而變短，細胞衰老。而生殖細胞和癌細胞則都有此酶，因此不衰老。以多莉為例，它的端粒限制性片段平均長度（mean Terminal Restriction Fragment，TRF）都比同齡對照羊短。

其四，雌、雄哺乳動物的基因劑量補償是通過滅活雌性動物的一條X染色體來實現。正常情況下，著床前胚胎的兩條X染色體都活動。後來，上胚層中 X 染色體隨機滅活，而滋養層細胞則專門滅活父系X染色體。小鼠克隆胚胎胚體的X染色體滅活方式是隨機的；即體細胞中活動X染色體Xa與滅活X染色體Xi之間不同的標誌在核移植後被擦除了，重新發生隨機滅活。但克隆胚的滋養層則保留了原有體細胞的X染色體滅活狀態。然而，死亡克隆牛X-連鎖基因在同一器官中有的表達，有的不表達，說明X染色體滅活不完全。死亡克隆胎盤X染色體隨機滅活，但活克隆為父親X染色體滅活。

圖丨科幻影視作品中的克隆人

最後就是克隆胚胎某些基因的再程序化異常。目前已有試驗證明，受精後父系和母系基因組都發生廣泛的去甲基化。牛正常胚胎在8-細胞前，甲基化程度進一步下降，到16-細胞時又開始再甲基化。克隆1-細胞胚胎的甲基化程度下降，但以後並不進一步去甲基化，而是提前發生再甲基化。克隆桑椹胚所有卵裂球的核都高度甲基化，類似於供核胎兒成纖維細胞。經過咖啡因或釩酸鹽處理的核能夠影響核轉移的發展和甲基化程度。還有人證明，牛著床前移核胚胎中有些重複序列的甲基化異常，某些胚胎基因往往不能再激活。這說明，大多數克隆胚胎的後成性再程序化異常，不徹底的再程序化可能是造成克隆成功率低的原因。

SCNT技術從20世紀發展至今還有許多問題沒有解決，然而這並不奇怪。孫強和蒲慕明通過試驗解決了1到0的問題，同時他們也打開了通往1到無限的門。剩下的就是拉力賽了，正如《我的滑板鞋》中的歌詞一樣，「時間會給你答案」。

-End-

參考：

1.Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer, Zhen Liu, Yijun Cai, Yan Wang, Yanhong Nie, Chenchen Zhang, Yuting Xu, Xiaotong Zhang, Yong Lu, Zhanyang Wang, Muming Poo, Qiang Sun

2.體細胞核移植技術的研究進展，王巍，付茂忠，唐慧，甘佳，方東輝，王淮，易君

3.BriggsRKing， TJProc.Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs』eggs［J］.Natl Acad Sc

4. McGrath J，Solter D. Structure and organization of the human Ki-ras proto-oncogeneandarelatedprocessedpseudogene

本書靈感源於「TR35」，即《麻省理工科技評論》享譽全球的「35 位 35 歲以下科技創新青年」（MIT Technology Review 35）青年人才榜，如果你想一睹全球科技創新領導者背後的精彩事迹，你也一定不能錯過這本書。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！