專家指南：如何評估細胞的健康狀況？（下）
於生物學研究而言，細胞是不可或缺的一部分。當然，細胞首先要健康，高品質的實驗結果才能有保證。那麼，如何評估細胞的健康？Biocompare此次請來了六位專家，與我們分享他們的知識和經驗，以幫助您獲得可靠的實驗結果。
3. 細胞健康需要多久評估一次，哪些特殊情況需要評估？
Bischoff：一般來說，在傳代細胞之前需要測定細胞的濃度和活力。當培養物老化時，監控細胞健康也很重要，因為細胞系的特徵也在隨之變化。如果細胞準備用於檢測，那麼最好在檢測前一天和檢測當天評估細胞濃度和活力。
Murphy：許多參數（比如生長、形態）很容易監控，應當定期/持續開展。在開始重要實驗之前，或者其他參數顯示細胞可能有問題，那麼應當考慮更具體的檢測，如使用活細胞/死細胞染色，或caspase的熒光抑製劑（FLICA）。具體方法要取決於細胞系，因為有些細胞更加敏感。
Patel：人們一般是在傳代或接種細胞時，利用台盼藍來評估細胞活力。這種方法雖然有用，但也只是粗略地測定某個時間點的活細胞/死細胞比例。更多的時候，研究人員想了解健康狀況的時間點是無法檢測的。因此，若評估已成為日常培養過程的一部分，相信會有所幫助。
至於多久評估一次細胞健康，這並沒有固定的說法。當然，在重要事件發生時，比如細胞接種，建議進行評估。如果細胞是你不熟悉的類型，或者它們容易分化，如原代細胞，則更應該定期評估。活細胞分析實現了非侵入性的評估，因此應成為標準培養流程的一部分。
4. 您是否能分享一些技巧或產品，幫助大家準確高效地評估細胞健康？
Blundell：最簡單的方法是使用不可固定的DNA結合染料，如PI、7-AAD或DAPI。在使用這些染料時，只需將它們添加到細胞懸液中並分析：帶有完整細胞膜的細胞不會發出熒光。不過這些染料也有缺點：它們不能被固定，多色分析的空間也有限。
現在也有一些可固定的細胞活力染料，如VivaFix Cell Viability Assay。事實上，它們提供一系列範圍廣泛的激發和發射光譜，適用於大多數的儀器，為實驗增添了靈活性。這些染料也適用於免疫熒光顯微鏡。
在使用試劑時，最好是按照說明書，使用正確的緩衝液。別忘了對照。如果你在進行多色實驗，記得使用補償對照。你可能需要陽性對照和陰性對照，來查看整個範圍的細胞反應。陰性對照可選擇重懸試劑的溶液。
此外，在實驗中要選擇合適的試劑。比如，測定凋亡的方式有很多種。如果你不確定某條通路work或你不想測定具體的通路，那麼可選擇通用的試劑。Caspase FLICA Apoptosis Detection Kit就能夠檢測幾乎所有哺乳動物細胞中的各種caspase，它們有四種不同形式可供選擇。相反，Caspase-9 FLICA Kit只適合凋亡的特定階段。
Bischoff：MilliporeSigma提供了簡便易用的分析，適合各種類型的細胞。我們的Muse細胞分析儀和Guava easyCyte儀器提供了「混合-讀取」形式的分析，只需10 μL的細胞樣品。Muse細胞分析儀是一個封閉的平台，有25種經過優化的分析，涵蓋細胞健康的各個領域；Guava則是一個開放的系統，最多具有三個激光器，適用於單管或平板的檢測。
Guthmiller：最佳方法取決於很多因素，包括你試圖測定的內容、擁有的儀器、你的樣品類型以及所需通量。許多商業化的分析以微孔板的形式評估細胞健康。對於簡單的細胞是/否健康的實驗，人們通常用四唑鹽（MTT、MTS）或刃天青染料將細胞轉化為讀板機可檢測到的彩色或熒光產物。不過，這些方法可能具有毒性，容易受到干擾。
對於珍貴的樣品或關鍵的應用，或通量更高的實驗，檢測ATP的方法最為簡單，因為它們的操作方案只是簡單的「加樣-混合-測定」，在10分鐘內就能提供數據。而且，它們更加靈敏，需要的細胞量更少，適合高通量的小型化實驗。
此外，也可以利用實時分析來監控細胞活力、毒性或凋亡，如RealTime-Glo Viability Assay或RealTime-Glo Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay，從而輕鬆確定細胞的最佳參數，或確定最佳的處理時間和濃度。監控培養基中營養物濃度的變化和細胞產生的代謝物，可以深入了解代謝的變化。
Murphy：ICT的Necrosis vs. Apoptosis Assay為同時檢測細胞凋亡和壞死提供了一種方便的方法。此試劑盒結合了一種紅色的活細胞/死細胞染料（7-AAD）和一種綠色的caspase檢測試劑（FAM-FLICA）。凋亡細胞表現為FAM-FLICA陽性（綠色），壞死細胞表現為7-AAD陽性（紅色），兩種均為陽性的是晚期凋亡細胞。
如果你擔心那些更輕微的健康狀況，它們不會快速演變為細胞凋亡或壞死的狀態，但又影響到實驗，那麼ICT的JC-1或TMRM/TMRE熒光線粒體膜電位檢測試劑盒也許是比較理想的選擇。
TAG:生物通 |