中國農科院哈爾濱獸醫研究所在流感病毒研究方面取得突破性進展

導言

禽流感病毒（Influenza A virus ，IAV）是一種具有八個分段基因組的單鏈負RNA病毒，可導致包括人類在內的許多動物物種感染流感。病毒的所有八段RNA都結合到三種RNA聚合酶並和由核蛋白（NP）包裝形成病毒核糖核蛋白複合物（vRNPs）。

流感病毒不斷進化變異，對動物和人類健康構成持續威脅，隨時可能引發新的動物疫情暴發和公共衛生危機。因次，需要深入研究流感病毒的致病機制，發現病毒複製過程中與之相互作用的宿主蛋白，揭示其參與病毒複製周期調控的機制，為研製新型抗流感病毒藥物以及干預治療提供理論依據。

近日，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家禽流感參考實驗室在國際病原學權威期刊《公共科學圖書館一病原體》（PLoS Pathogens）上在線發表了題為「Phospholipid scramblase 1 interacts with influenza A virus NP, impairing its nuclear import and thereby suppressing virus replication"的研究論文，該實驗室博士生羅維玉和碩士生張傑在李呈軍研究員、姜麗副研究員和陳化蘭院士的指導下，篩選到與流感病毒NP蛋白直接互作的宿主蛋白磷脂爬行酶1（PLSCR1），發現PLSCR1通過與NP蛋白結合抑制NP和病毒核糖核蛋白複合體（vRNP）進入細胞核，延緩病毒整個複製周期，進而顯著抑制流感病毒的增殖。進一步研究發現，PLSCR1、NP以及輸入蛋白α（Importin α）三者之間形成三聚體，阻礙細胞核輸入通路關鍵因子輸入蛋白β（Importin β）與Importin α的結合，阻止流感病毒NP和vRNP複合體通過主動輸入途徑進入細胞核，從而抑制流感病毒複製。

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鑒定出與流感NP蛋白相互作用的細胞蛋白。為了鑒定出與流感病毒NP蛋白相互作用的宿主細胞蛋白，該文作者利用酵母雙雜交系統從一個人混合細胞培養產生的cDNA文庫（A549，HEK293T，THP-1和U251）中進行篩選。以來自毒株（安徽/ 2/2005）的全長NP蛋白（ah05，H5N1）作為誘餌，篩選到一個含有PLSCR1（磷脂爬行酶1）完整的開放閱讀框（GenBank登錄號nm_021105 PLSCR1）特異性克隆，然後再通過酵母共轉化再次檢驗PLSCR1與NP之間的相互作用，結果如下圖所示，PLSCR1與NP在酵母中發生了特異性相互作用。

作者進一步採用免疫共沉澱實驗來研究PLSCR1與NP之間的相互作用。V5標籤的WSN NP和FLAG標記PLSCR1，單獨或組合轉染HEK293T細胞。用細胞裂解液與抗V5的單克隆抗體進行免疫沉澱實驗，然後用兔抗V5或抗Flag標籤多克隆抗體免疫轉印技術分析（Western blot）。FLAG標記PLSCR1與 V5標記的NP蛋白（WSN，33 H1N1）共表達時發生免疫共沉澱，但不是在缺乏WSN NP的情況下，該結果表明PLSCR1與流感NP蛋白在哺乳動物細胞中發生了相互作用。

為了研究PLSCR1與NP蛋白相互作用在流感病毒生命周期中的影響，作者研究分析了上調PLSCR1對病毒複製的影響，用編碼PLSCR1的逆轉錄病毒轉染A549細胞建立穩定表達PLSCR1的細胞系，同時建立對照組，結果如預期所示，與對照組相比，在PLSCR1過表達細胞中PLSCR1的表達在mRNA水平和蛋白水平均表現出增加。

本文通訊作者、國家禽流感參考實驗室主任陳化蘭院士指出，該項研究進一步完善了流感病毒與宿主蛋白形成的相互作用網路，深化了對流感病毒複製周期的理解，為研製新的抗流感病毒藥物提供了潛在的靶點。

ABSTRACT:Transcription and replication of the influenza A virus (IAV) genome occur in the nucleus of infected cells and are carried out by the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). As a major component of the vRNP complex, the viral nucleoprotein (NP) mediates the nuclear import of the vRNP complex via its nuclear localization signals (NLSs). Clearly, an effective way for the host to antagonize IAV infection would be by targeting vRNP nuclear import. Here, we identified phospholipid scramblase 1 (PLSCR1) as a binding partner of NP by using a yeast two-hybrid (Y2H) screen. The interaction between NP and PLSCR1 in mammalian cells was demonstrated by using co-immunoprecipitation and pull-down assays. We found that the stable overexpression of PLSCR1 suppressed the nuclear import of NP, hindered the virus life cycle, and significantly inhibited the replication of various influenza subtypes. In contrast, siRNA knockdown or CRISPR/Cas9 knockout of PLSCR1 increased virus propagation. Further analysis indicated that the inhibitory effect of PLSCR1 on the nuclear import of NP was not caused by affecting the phosphorylation status of NP or by stimulating the interferon (IFN) pathways. Instead, PLSCR1 was found to form a trimeric complex with NP and members of the importin α family, which inhibited the incorporation of importin β, a key mediator of the classical nuclear import pathway, into the complex, thus impairing the nuclear import of NP and suppressing virus replication. Our results demonstrate that PLSCR1 negatively regulates virus replication by interacting with NP in the cytoplasm and preventing its nuclear import.

原文鏈接：

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006851

參考：哈獸研官網

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