專家指南：如何評估細胞的健康狀況？（上）
對於生物學研究而言，細胞是不可或缺的一部分。當然，細胞首先要健康，高品質的實驗結果才能有保證。那麼，如何評估細胞的健康？Biocompare此次請來了六位專家，分享他們的知識和經驗，以確保您獲得可靠的實驗結果。
專家小組的成員包括：
Bio-Rad的產品經理Mike Blundell博士
MilliporeSigma的主管Klaus Bischoff
Promega的產品經理Pam Guthmiller
ImmmunoChemistry Technologies的研發主管Tracy Murphy
ATCC Cell Systems的高級主管Robert Newman
Essen BioScience（賽多利斯）的研發科學家Kalpana Patel
1. 您可以談談評估細胞健康的重要性嗎？
Blundell：對許多實驗而言，研究人員必須使用健康的細胞，才能準確評估細胞反應、處理和存活。如果細胞群體從一開始就不健康，或者說細胞的健康狀況未知，那麼就很難評估在實驗過程中觀察到的各種變化的意義。
在實驗過程中，必須通過多個標準來測量細胞的健康狀況，以確保結果是可重複的。細胞活力是關鍵的指標之一，但並不是唯一的指標。細胞健康也可以通過增殖、凋亡和自噬的測定來評估。
分離健康的細胞對流式分析而言很關鍵。在流式實驗中用抗體染色細胞時，抗體可能與死細胞發生非特異性結合，導致背景噪音增加。這種噪音不僅產生假陽性的結果，還會降低多色分析的信號解析度。熒光會擴散，掩蓋了微弱的熒光信號。
Bischoff：若利用事先未檢測活力或增值的細胞來開展分析，則可能導致錯誤的結果，對研究人員而言也是代價極大的。例如，如果在化合物處理之前細胞瀕死或死亡，則細胞很有可能顯示出非特異的誘導作用。若開展固定或透化實驗，則可能觀察到大量細胞的損失。
Guthmiller：強烈建議您的實驗室按照標準的操作程序，來培養和處理您的細胞。具體包括建立細胞庫、污染檢測、細胞系認證、在使用穩定轉染的細胞系時記錄傳代次數，並確定適當的細胞鋪板數，讓它們不至於太過擁擠。如果細胞用來表達蛋白質，那麼合適的培養條件是必不可少的。建議讀一讀《動物細胞培養——基本技術和特殊應用指南》（第六版）。
2. 確定細胞健康的關鍵參數有哪些？
Blundell：關鍵參數包括：(1) 細胞活力。這可以利用非通透性的DNA結合染料（如PI或7-AAD）來測定。(2) 增殖反應。即使細胞看上去很健康，並且有活力，但也未必能增殖，這可能影響實驗的結果。(3) 細胞凋亡和自噬水平。這些指標可檢測細胞死亡或應激的早期跡象。
Bischoff：一般來說，細胞活力和濃度一直是細胞健康的標誌。不過近年來，這種觀點已經發生了變化。人們認識到還有其他重要的參數。快速測定細胞濃度和活力是研究人員必須定期獲得的基本數據。不過，定期評估細胞凋亡和線粒體擾動，還可以提供更早期且更靈敏的細胞健康變化指標。
Murphy：我們實驗室監控的一些參數包括生長速率（倍增時間）、細胞形態（顯微鏡下的大小/性狀/外觀）、濃度（3 x 105-7 x 105個細胞/ml是比較理想的濃度）。我們還觀察了流式分析的前向散射（FSC）和側向散射（SSC）圖像。對於健康的細胞群體，FSC和SSC的特徵應該是相對一致的，表明不存在過量的細胞碎片或小顆粒。
活細胞/死細胞染料（如7-AAD和PI）為測定細胞活力提供了一種快速而簡單的定量方法，在10分鐘之內就能獲得結果。如果時間允許的話，利用FLICA（熒游標記的caspase抑製劑）來檢測caspase活性，可提供一幅更詳細的細胞健康圖像。
這是因為caspase活化通常在凋亡過程的極早期發生，比細胞膜受損更早。
如果癥狀極為輕微，但又影響到實驗，那麼不妨評估一下線粒體的極化狀態。培養中的營養因子變化以及傳代次數過多，都可能影響細胞的健康狀況。這時的細胞不一定會馬上轉變為凋亡或壞死狀態。它們可能表現為線粒體極化狀態的減少。利用膜電位染料可儘早發現這些潛在問題，避免後續實驗浪費時間和精力。
Newman：細胞健康的關鍵參數包括細胞活力和表型指標，如形態學、細胞標誌物的表達，以及細胞的生物功能。另外，您也可以檢測代謝物、凋亡標誌物、應激信號、毒性標誌物或細胞溶解指標，具體取決於您的目標。
Patel：通常人們利用膜完整性檢測來評估死細胞的比例，從而確定細胞健康的狀況。然而，更可靠的方法是評估活細胞的健康狀況。生長速率可作為一個更可靠的細胞健康指標，來評估那些影響增殖但不導致死亡的微妙變化。細胞代謝活性（LDH、ATP、DTT、alamarBlue）可取代細胞數量的測定，不過，這只是提供了某個時間點的信息。利用活細胞分析技術全程監控細胞增殖可以帶來更多的信息。與健康的細胞相比，不健康的細胞可能表現出增殖速率的改變。
TAG:生物通 |