CRISPR——從研究中的基因編輯利器到潛在的臨床治療工具

CRISPR基因編輯

2013年，MIT的張鋒課題組率先在哺乳動物細胞中利用CRISPR/Cas9系統進行基因編輯，為整個學界帶來了一種革命性的研究工具1。相比於此前的ZFN、TALEN等基因編輯技術，經由RNA介導的CRISPR在精確性、效率性、便利性等方面展現出了巨大的優勢，並迅速成為實驗室中用於基因敲除、基因敲入、基因修飾等基因編輯步驟的「明星系統」。而近年來，基於Cas9突變體的dCas9系統又被用於可操縱的定點染色質修飾，在表觀遺傳學研究領域內得到廣泛的認可。

基因編輯

在臨床試驗中的應用

長久以來，基因編輯一直被認為是用於治療基因組相關疾病最直接有效的手段。但早期的轉基因技術卻因精確性、安全性等問題，在多次臨床試驗中折戟沉沙。而近年來興起的免疫療法、幹細胞療法等，也對更高效、更精準的基因編輯手段提出了要求。於是，業已在實驗室中證明其巨大潛力的CRISPR技術，成為了臨床基因治療領域的新利器。

最早採用CRISPR基因編輯針對人類疾病的研究主要在抗病毒領域。由於病毒在溶源性狀態下難以被宿主免疫系統識別，因而往往造成沉痾難愈的情形，此時使用基因編輯直接靶向宿主細胞整合的病毒基因組無疑是最為直接可行的方案。2013年的一篇報導成功在體外利用CRISPR靶向人類T細胞中的溶源態HIV病毒，暗示了這一療法的可行性2。此後，類似的研究在乙肝病毒3、人乳頭瘤病毒4上也得到了可行性驗證。儘管還沒有進一步的動物模型與臨床試驗證據，但CRISPR在基因編輯治療方面的潛力已毋庸置疑。

遺傳病無疑是基因編輯治療的「主場」。早在2015年，就已經有報導以病毒為載體，導入CRISPR系統到小鼠模型中進行基因編輯，進而改善杜氏肌營養不良的癥狀5。此後，運用CRISPR基因編輯治療遺傳性疾病的研究就一直得到廣泛關注。去年年底，一篇於Nature發表的文章報導了在哺乳動物模型中利用基於CRISPR的基因編輯手段治癒遺傳性失聰的案例6。在該報導中，研究者使用了Tmc1Bth/+小鼠模型，該小鼠Tmc1基因的一個拷貝發生了突變，使得細胞同時編碼產生野生型和突變型的Tmc1蛋白。Tmc1在哺乳動物中是十分保守的，並對於耳毛細胞行使正常功能十分關鍵，突變型Tmc1的產生會導致人或小鼠的遺傳性失聰。報導中，研究者們利用CRISPR系統在小鼠內耳細胞中成功敲除了突變型的Tmc1拷貝，並最終使致病小鼠在一定程度上恢復了聽力。（如圖1，圖2）

圖1. 研究者使用CRISPR系統敲除突變型的Tmc1拷貝，使耳毛細胞恢復正常功能7（Urnov F, Nature, 2018）

圖2. a. Tmc1突變敲除小鼠相比於突變小鼠的聽力有了顯著恢復；b. 就致病小鼠個體而言，Tmc1突變敲除耳相比於對照耳聽力有顯著上升

（David R. Liu,Nature,2017）

值得注意的是，該報道採用了脂質體而非傳統的病毒作為導入CRISPR系統的載體。CRISPR的病毒載體會將Cas9與sgRNA基因整合到宿主基因組上進行持續性表達，不可避免地帶來星號活性，而在過去基因療法試驗中，病毒本身引起的免疫反應也是一個巨大的障礙，甚至引發臨床安全問題。因此，使用幾年前開發的脂質體球直接導入Cas9蛋白與sgRNA的技術8，可以有效地規避這些風險，並十分適用於這類「一次性」的臨床基因編輯。

當然，通過CRISPR進行基因編輯，究竟在人類疾病的治療中有何表現，還需要具體臨床試驗證明，而這些試驗正在逐漸展開。2016年，美國NIH批准了第一例CRISPR基因編輯的臨床試驗9，具體內容是在體外利用CRISPR編輯患者T細胞基因組，賦予其更高的靶向性，並降低自抑制能力，移除可被腫瘤細胞偵測的抗原。通過這些編輯，獲得更強對腫瘤免疫能力的T細胞將被重新注入患者體內，發揮免疫治療的功效。而在近期，另一項名為CTX001的基於CRISPR的基因編輯療法在歐洲提出了臨床試驗申請10，（圖3）該療法針對β地中海貧血症和鐮刀型貧血症，通過在體外編輯患者的造血幹細胞，提高其胎兒血紅蛋白的表達能力，再回輸至患者體內達到治療效果。

圖3 CTX001基因療法治療β地中海貧血症/鐮刀型貧血症的流程示意（CRISPR Therapeutics）

CRISPR的未來

CRISPR系統從最初用於哺乳動物細胞至今亦不過四五年光景，還是一項相當年輕的技術。但在短短數年間，它已經顯示了其作為新一代基因編輯工具在臨床治療領域的巨大潛力。我們可以預期的是，在未來會有更多的CRISPR基因編輯療法的臨床研究，我們也期待這些研究會為當下醫療領域開拓新的道路。

作者：Chromatin

參考文獻：

1. Cong, Le, et al. "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems." Science 339.6121 (2013): 819-823.

2. Ebina, Hirotaka, et al. "Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus." Scientific reports 3 (2013).

3. Kennedy, Edward M., et al. "Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease." Virology 476 (2015): 196-205.

4. Kennedy, Edward M., et al. "Inactivation of the human papillomavirus E6 or E7 gene in cervical carcinoma cells by using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided endonuclease." Journal of virology 88.20 (2014): 11965-11972.

5. Nelson, Christopher E., et al. "In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy." Science 351.6271 (2016): 403-407.

6. Gao, Xue, et al. "Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents." Nature(2017).

7. Urnov, Fyodor. "biotechnology: An ode to gene edits that prevent deafness." Nature 553.7687 (2018): 162-163.

8. Zuris, John A., et al. "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo." Nature biotechnology 33.1 (2015): 73-80.

9. Reardon, Sara. "First CRISPR clinical trial gets green light from US panel." Nature 531 (2016).

10. http://crisprtx.com/our-programs/our-programs.php

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