高特異性CAR-T免疫療法-艾伯特-路德維希-弗萊堡大學2017 iGEM項目簡介
艾伯特-路德維希-弗萊堡大學2017年iGEM參賽隊伍的基本信息：
iGEM比賽年度：2017年
隊名：Freiburg
學校：艾伯特-路德維希-弗萊堡大學（Albert-Ludwigs-University of Freiburg）
類別（Kind）：大學生（Collegiate）
組別（Section）：研究生組（Overgraduate）
地區：歐洲
國家：德國
領域/板塊（track）：療法（Therapeutics）
艾伯特-路德維希-弗萊堡大學2017年iGEM參賽隊伍的獲獎情況：
單項獎（Award）：
最佳新基礎部件提名（Nominated for Best New Basic Part）
最佳Wiki提名（Nominated for Best Wiki）
獎牌（Medal）：金獎（Golden Medal）
項目名稱：
CARtel - Chimeric Antigen Receptor on T cells Expressed Locally in the Tumor Microenvironment
項目wiki：
http://2017.igem.org/Team:Freiburg
CAR-T免疫療法
癌症是醫學研究必須克服的最重要挑戰之一。癌變組織主要來源於健康細胞，其主要是通過遺傳改變來調節正常細胞過程，尤其是生長和代謝來產生的。由於這個原因，治療癌症具有很大挑戰性的，因為每種癌症是不同的，並在一直不斷變化，使得很難找到最好的治療方法。放射療法或化學療法等常見方法可能導致嚴重的短期和長期副作用。為了避免這些問題，癌症治療發展的重點轉向免疫治療。這裡免疫系統對抗癌細胞的能力正在得到提高。在過去的幾年中，嵌合抗原受體（CAR）T細胞免疫療法（Jackson等，2016; Fesnak等，2016）成為最受關注的免疫療法。
在基於CAR的免疫治療中，從患者血液中提取T細胞並進行基因修飾以組成型表達CAR。T細胞或T淋巴細胞是胸腺中成熟的免疫系統細胞，具有對抗病原體和癌症的多種功能。將遺傳修飾的T細胞重新注射入患者，在那裡它們表現出通過CAR靶向癌細胞的增強的能力。CAR是由T細胞受體的信號傳遞亞單位和抗體的可變區組成的合成受體，由此將抗原結合功能與T細胞活化相結合。目前，CAR治療正在進行B細胞淋巴瘤的臨床試驗，其中兩項最近被FDA批准用於治療（臨床研究CCTL019B2202，Neelapu等，2017）。
在T細胞上表達的嵌合抗原受體（CAR）。
CAR T細胞免疫治療面臨的一個挑戰是出現了主要副作用，移植物抗宿主病（GVHD）。CAR所識別的抗原不是腫瘤細胞所特有的。因此，呈遞相同抗原的健康細胞可被CAR T細胞靶向，導致健康組織的損傷（Hartmann等，2017; Morgan等，2010）。
將（腫瘤微環境中發生的）選擇的輸入整合到CAR輸出中。
為了解決這個問題，弗萊堡大學2017 iGEM團隊提出了一個觀點：CAR的局限性表達可以防止脫靶效應。對於本項目，弗萊堡大學團隊設計了一個由實體腫瘤微環境激活的遺傳邏輯與門。通過與門CAR調節僅在T細胞在腫瘤組織內時才表達。CAR表達的局部限制應該能夠降低脫靶效應的風險。
改善CAR T細胞免疫療法的方法是基於T細胞的基因工程，以僅在特定的腫瘤微環境中表達CAR。這將允許治療癌症患者而不損害修飾的T細胞的內源性免疫原性，補充常規的癌症治療，並且還將嚴重副作用的風險降至最低。
CAR-T細胞
CAR T細胞是經過人工設計表達特異性嵌合抗原受體（CAR）的免疫細胞，在抗癌方面表現出了巨大的潛力。
圖1：嵌合抗原受體的結構。示例顯示的是嵌合抗原受體的結構，其由來源於單克隆抗體的細胞外識別結構域和由信號亞基組成的細胞內結構域組成。
嵌合抗原受體（CAR）是人工產生的顯示抗原結合和T細胞活化能力的重組受體（Sadelain等，2013）。CAR由來源於單克隆抗體的細胞外識別結構域和包括CD3和共刺激結構域的細胞內信號傳導結構域組成，旨在觸發T細胞的內源性信號傳導途徑。CAR的識別結構域靶向在癌細胞表面表達的特異性分子，從而引發顯著的應答，包括由信號傳導結構域介導的T細胞的激活和殺傷活性（Zhang等，2017）。作為過繼性細胞轉移（ACT）的一種方法，CAR T細胞治療顯示出降低的毒性，因為這是患者自身的免疫細胞被收集和修飾以治療其癌症。
CARTELTM療法如何工作？
首先通過單采血液採集患者的T細胞，然後在實驗室中進行培養和設計。這些工程化T細胞注入患者體內，只能在腫瘤微環境中表達CAR，而不是像目前的CAR治療一樣是組成型表達的（圖2）。
圖2：CARTELTM治療的示意圖
批准的CAR T細胞療法
在過去的幾年裡，CAR T細胞療法取得了很大的進展。迄今為止，FDA批准了兩種CAR T細胞療法。第一個是Novartis的Kymriah，用於治療B細胞前體急性淋巴細胞白血病（ALL）的年輕成人；第二個是Yescarta，用於治療某些類型的大B細胞淋巴瘤的成人。然而，CAR T細胞治療仍然面臨許多挑戰（Magee，2014）。到目前為止，大多數CAR主要用於造血系統惡性腫瘤（包括ALL）而不是實體癌症。此外，潛在的副作用仍在調查中。因此，弗萊堡大學團隊希望能夠解決這一發展中的合成免疫治療領域，希望通過控制CAR在某些腫瘤微環境中的表達來使這種有希望的方法更安全，這可能允許CAR來治療實體瘤。
腫瘤微環境
腫瘤微環境（TM）是指腫瘤周圍的細胞環境，包括血管，正常細胞和分子。腫瘤與其微環境之間的相互作用導致不同的生理過程為腫瘤發生提供有益的和不利的後果（Quail & Joyce，2013）。一般而言，腫瘤細胞中的基因表達改變導致各種分子（例如細胞因子，生長因子和細胞組分）的分泌，例如外泌體募集間質和血管細胞（Quail &Joyce，2013；Mittal等，2014）。另外，在腫瘤微環境中也可以發現各種免疫效應細胞，但是由於腫瘤衍生信號如細胞因子，它們的抗腫瘤功能下調（Whiteside，2008）。有幾個因素與健康間質相比有所改變。下面我們將重點介紹一些主要的因素。
腫瘤的關鍵特徵之一是其快速生長，反過來導致缺氧，稱為缺氧（hypoxia）（Yotnda等，2011）。缺氧（圖3）是整個腫瘤生長的不斷變化的參與者（Patel & Sant，2016; Kim等，2009），並且仍然是腫瘤微環境中血管生成的主要調節因子（Mittal等，2014）。健康組織中氧的實際生理水平為3-6％（Tian & Bae，2012），而腫瘤的實際生理水平約為1％（McKeown，2014），這可能是區分健康組織和腫瘤的重要因素。
圖3：腫瘤微環境 在腫瘤微環境中，VEGF（血管內皮生長因子）的水平增加，而細胞外pH值和氧濃度降低，從而形成酸性和低氧環境。
為了克服這種氧氣限制，腫瘤典型地誘導血管生成以產生其專用於氧氣和其他營養物質的血液供應。為此，它分泌各種生長因子，包括血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。VEGF（圖3）促進血管生長並被認為是腫瘤微環境的組成成分（Mittal等，2014）。
此外，酸性細胞外pH值（圖3）是腫瘤組織的主要特徵，這是由於無氧酵解的乳酸和來自磷酸戊糖途徑的CO2（Kato等，2013）。人類患者不同腫瘤結節的研究表明，平均細胞外pH值為7.0，而生理pH值為7.4（Tian & Bae，2012）。
決定腫瘤性質的因素被認為是開發靶向治療的最可能治療方法。缺氧，低pH和VEGF是腫瘤微環境的三個共同特徵。因此，弗萊堡大學團隊選擇這些條件來控制嵌合抗原受體（CAR）在T細胞中的表達。
與（AND）門
AND門是邏輯電路的一部分，常用於合成生物學中（Wang 等，2015）。 這個想法是把輸入和輸出結合起來。 對於一個與門，兩個輸入將被整合以產生一個輸出。
圖4：與門.與門是一個邏輯電路，將兩個輸入（A和B）集成到一個輸出中。 如果給出了一個輸入（左邊），則不會有輸出。 只有兩個輸入（右）都被集成時，輸出才會被創建。
為了建立必要的或最佳的輸入量，使輸出在計算機模擬中得以實現。 為此，以下是正確的：如果給出兩個輸入（+/+），則輸出為「ON」。 如果僅給出一個輸入（(+/-或-/+）或無（-/-），則輸出為「OFF」（圖1）。 這個系統可以投入邏輯功能（Lomnitz & Savageau，2016）。 在本項目中，弗萊堡大學團隊使用這種方法來控制表達輸出，即嵌合抗原受體（CAR）。 用於產生這種輸出的兩個輸入是高VEGF濃度和低氧條件或者低pH和低氧條件。
如果僅給出兩個輸入中的一個，則CAR不會被表達，CAR-T細胞將不能與其靶抗原結合。 通過CAR的依賴性表達，考慮到VEGF和缺氧條件或低pH和低氧僅應在直接腫瘤微環境中給予，項目團隊希望對實體腫瘤細胞具有更高的特異性。 這將導致免疫治療安全性的提高。
缺氧
由於腫瘤微環境中的氧濃度降低，細胞必須響應缺氧（1％氧），並且基因表達必須被激活。為此，細胞具有HIF（缺氧誘導因子），其是異二聚轉錄因子並且由缺氧依賴性α亞基和組成型表達的β亞基組成（Pescador等人，2005）。在本項目中，弗萊堡大學團隊專註於HIF1，但也有HIF2和HIF3。儘管它們以相似的方式進行調控，但是組織中的功能和分布各不相同（Pescador等人，2005）。
在含氧量正常的條件下，HIF1A被羥基化，並被E3泛素連接酶標記，導致蛋白酶體降解。然而，在缺氧條件下HIF1A是穩定的，可以與HIF1B異二聚化。然後，HIF1可以與細胞核中的低氧反應元件（HRE）結合，並導致感興趣基因的表達（圖5）（Ziello等，2007），在CARTELTMAND門的情況下是CAR。由於HIF1A已經內源性表達，所以有必要產生內源性HIF1A的敲除或敲低，以便能夠將其重新引入到CARTELTM門中。否則，內源性HIF1A將能夠干擾CARTELTMAND門並導致其激活，而不存在所選擇的第二輸入。
圖5：HIF1A信號通路。在常氧條件下，HIF1A會降解。 然而，在低氧條件下，它將會穩定下來並能夠與其伴侶HIF1B二聚化。 然後HIF1能夠進入細胞核並結合HRE啟動子元件，導致目的基因（GOI）的表達。
VEGF（血管內皮生長因子）
VEGF是CARTELTMAND門的選擇輸入之一。通常它會引發血液凝固，但在本項目的系統中它被用來驅動HIF1A的表達。為此使用VEGF的內源途徑，其功能如下：VEGF-A主要被其受體VEGFR-2（血管內皮生長因子受體2）識別，該受體經常在腫瘤細胞上表達（Miettinen等，2013）。VEGFR-2是受體酪氨酸激酶，在其活化劑VEGF結合後導致磷酸化步驟。此外，細胞內鈣濃度增加，並且依賴於鈣的磷酸鈣鈣調磷酸酶被激活。然後，鈣調神經磷酸酶能夠使轉錄因子NFAT（活化的T細胞的核因子）去磷酸化，然後其能夠進入細胞核並激活CTLA4（細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4）啟動子（Minami等，2013）導致目的基因的表達（圖6）-在本項目中的例子是HIF1A。
圖6：VEGF信號傳導途徑。VEGF-A可以被VEGFR-2（血管內皮生長因子受體）感知。 受體激活後，細胞內Ca2 +水平升高，Ca2 +可與鈣調蛋白複合物結合。 然後鈣調神經磷酸酶可以與複合物結合併導致NFAT（活化的T細胞的核因子）的去磷酸化。 NFAT可以進入細胞核並與CTLA4（細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4）啟動子元件結合，然後導致感興趣基因（GOI）的表達。
pH
低pH值是AND門的另一種可能輸入，也是VEGF輸入的替代。細胞外質子可以被受體TDAG8（T細胞死亡相關基因8）感知，也被稱為GPR65（G蛋白偶聯受體65）並導致G蛋白的激活。G蛋白激活腺苷酸環化酶，其能夠將ATP轉化成環AMP（cAMP）。cAMP可以結合併激活PKA（蛋白激酶A），從而釋放轉位到核中的亞基，在該核中磷酸化轉錄因子CREB1（cAMP應答元件結合蛋白1）。CREB1可以結合合成的CRE啟動子（Ausl?nder等，2014），導致HIF1A的轉錄。
圖7：TDAG8信號通路。TDAG8（T細胞死亡相關基因8）是一種Gs（G蛋白）偶聯受體，能夠感受酸度。 如果被激活，它會激活腺苷酸環化酶，然後將ATP轉化成cAMP（環AMP）。 cAMP與蛋白激酶A相互作用，亞基將被切割掉。 亞基能夠進入細胞核並激活CREB1（cAMP反應元件結合蛋白1）。 然後CREB1可以與CRE啟動子元件結合併導致感興趣基因（GOI）的表達。
HIF1A敲低
消除HIF1A
設計用於控制腫瘤微環境中的嵌合抗原受體（CAR）表達的遺傳電路依賴於通過引入的與門來獨佔控制缺氧誘導因子1α（HIF1A）。需要通過採用各種策略來獲得HIF1A缺陷型細胞。
CRISPR / Cas9與同源性定向修復（HDR）
CRISPR / Cas9（Ran等人，2013）系統（常間迴文重複序列叢集/常間迴文重複序列叢集相關蛋白9）允許基因的精確編輯。Cas9內切酶與引導RNA（gRNA）形成複合物，並在與gRNA互補的位點引入DNA雙鏈斷裂（圖1）。這些都是由不同的內源性修復機制修復的，具體情況取決於。一個稱為同源性定向修復（HDR）的過程可以通過與包含與靶標同源的區域的修復模板共轉化來觸發。
使用來自化膿性鏈球菌的Cas9的質粒試劑盒通過HDR敲除HIF1A（由OriGene公司贊助）。這是用含有不同gRNA的兩種質粒進行的，兩種質粒均靶向人HIF1A的第一個外顯子，靠近轉錄起始位點。綠色熒光蛋白（GFP）和嘌呤黴素抗性的報道基因通過修復模板穩定整合。
圖8：CRISPR / Cas9機制的示意圖。 Cas9核酸內切酶通過共轉染的指導RNA（gRNA）識別所需的靶標，其含有與靶基因互補的NGG位點相鄰的20個核苷酸。 Cas9誘導NGG上游3-4個核苷酸處的雙鏈斷裂。 內源性機制通過非同源末端連接（NHEJ）修復斷裂，產生隨機插入和缺失，或通過在裂解位點整合修復模板的同源定向修復（HDR）。
CRISPR / Cas9誘導非同源末端連接（NHEJ）
CRISPR / Cas9系統也可以在沒有修復模板的情況下使用。這迫使細胞通過非同源末端連接（NHEJ）修復雙鏈斷裂，這是一個容易出錯的過程。在切割位點，核苷酸隨機添加並在修復過程中除去，導致缺失，取代和插入。這產生了基因翻譯框架的隨機移動，消除了基因產物的功能。
為了採用這種策略，使用Broad Institute的遺傳擾動平台（Genetic Perturbation Platform，GPP；Doench等，2016）設計了gRNA。使用程序CRISPR / Cas9靶在線預測器（CCTOP; Stemmer等，2015）預測脫靶效應。將最有希望的候選物插入到編碼具有GFP或嘌呤黴素抗性的Cas9（化膿性鏈球菌）作為選擇標記的質粒中（Ran等，2013）。
RNA干擾
抑制基因表達的另一種技術是RNA干擾，其中翻譯被與靶mRNA結合的反義RNA抑制（Fire等，1998）。這切割mRNA或防止翻譯機制並導致蛋白質生產的結合。弗萊堡大學團隊的方法涉及將此類短髮夾RNA（shRNA）穩定的慢病毒轉導入細胞以獲得HIF1A mRNA的下調。這些shRNA依賴於內源性轉錄後沉默（PTGS）機制（圖9）。
由於在本項目中HIF1A基因產物的敲低被用於允許通過合成構建體來控制該基因的表達，所設計的shRNA序列與內源性mRNA而不是引入基因的互補是至關重要的。因此，該轉錄物的3"UTR被用作shRNA序列設計的靶標。shRNA序列克隆的慢病毒轉移質粒含有青色熒光蛋白（CFP）和新黴素抗性標記。
圖9：RNA干擾的機制示意圖。 將shRNA基因整合到基因組中並轉錄後，將前體shRNA通過DICER加工成siRNA。 成熟的siRNA與幾種蛋白質結合到RNA誘導的沉默複合物（RISC）中，該沉默複合物能夠通過阻斷核糖體的翻譯或通過啟動經由PTGS的靶mRNA的降解來沉默期望的基因。
項目展望
CAR-T免疫療法雖然具有巨大潛力，且已有數家公司被批准進行CAR-T臨床實驗，但其仍存在脫靶攻擊正常細胞的風險。弗萊堡大學團隊在本項目中致力於進一步完善CAR-T療法：他們選擇腫瘤微環境的三種區別於正常細胞的因素，缺氧、低pH和VEGF，通過與門基因電路來識別是否其中兩種同時存在，來控制輸出端，即CAR-T細胞的產生。這種策略極大的提高CAR-T療法靶向癌細胞的特異性，降低了脫靶風險，將現有CAR-T療法的發展推動至了一個新的高度。
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