PD-1抑製劑Nivolumab免疫治療過程中的腫瘤及微環境進化研究

眾多研究表明，免疫檢查位點抑製劑能夠改善多種腫瘤治療後的總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）[1]。而腫瘤的微環境特徵（TME）通常會與免疫檢查點抑製劑的治療響應有關：比如在TME中PD-L1的表達，會與不同腫瘤類型的抗PD-1/PD-L1療法的療效相關[2,3]。另外，TME也有可能會限制效應T細胞對腫瘤細胞的滲入，從而減弱T細胞的擴張，或直接降低浸潤淋巴細胞（TILs）的存活力[4]。然而，對於檢查點抑製劑是如何介導免疫激活來調節腫瘤的突變分布和影響腫瘤微環境的機理仍然知之甚少。

對此，來自美國紐約紀念斯隆-凱特琳癌症中心的研究團隊在2017年11月的Cell雜誌上發表的研究成果表明：基於全外顯子測序、轉錄組測序以及T細胞受體（TCR）測序的多組學聯用策略，對68個患有晚期黑色素瘤患者在使用Nivolumab藥物（Nivo；抗PD-1藥物）前後其基因組信息變化進行了綜合性分析。該研究結果揭示了Nivolumab藥物的作用機制和腫瘤微環境進化間的關係[5]。

研究亮點

1. 作為一項前瞻性試驗揭示了抗PD-1治療的分子機制；

2. 抗PD-1治療能誘導腫瘤突變負荷的發生變化；

3. 用藥前後腫瘤基因表達模式變化顯著並與臨床反應相關聯；

4. 在免疫檢查點阻斷之後，T細胞受體數目發生改變。

實驗結果

在Nivolumab藥物（Nivo）處理前後黑色素瘤的基因組特徵的改變

首先，研究人員對68位黑色素瘤患者進行全外顯子測序（平均測序深度168X），其中有35位病人曾經使用過ipilimumab（Ipi）進行治療。可以看到，病人中其突變數目的中位值為183，但在有或無ipilimumab治療史的患者之間並沒有顯著差別。另外，根據TCGA資料庫定義的用於分析黑色素瘤突變亞克隆結果可知，在有或無ipilimumab治療史的患者間對Nivolumab藥物（Nivo）的反應也並無顯著差異。特別地，作者發現腫瘤的突變負荷跟接受過Ipi治療的患者其治療後總生存期無關，而在這些接受過Ipi治療的患者中其腫瘤克隆的突變數目偏低。

隨後，作者對接受Nivo治療的患者作出深入分析，判斷使用Nivo藥物是否會對腫瘤突變負荷與瘤內異質性產生影響。結果表明，在Nivo藥物使用四周後，基因突變數目以及腫瘤抗原數目均發生顯著下降（圖1）。

圖1. 免疫療法對腫瘤突變分布及基因組特徵的塑造

隨後，作者進一步分析了腫瘤構成的改變與Nivo藥物治療的關係：將樣本分為兩組，即Nivo藥物處理前與處理後。結果發現，在不同響應組之間的腫瘤克隆構成存在明顯變化。

圖2. 經使用Nivo治療處理後腫瘤克隆構成的改變

Nivolumab藥物治療前後的轉錄組水平分析

使用RNA-seq對患者腫瘤組織RNA進行表達差異基因分析，發現高表達的基因均為免疫相關基因，暗示著在用藥前就存在針對於腫瘤的免疫識別。另外，作者通過GO注釋，發現這些高表達基因在T細胞活性增強以及淋巴細胞聚集功能方面存在富集（圖3）。

圖3. 施展治療前腫瘤基因表達差異分析

與此同時，作者做出這樣的假設：即抗PD-1療法能夠誘導腫瘤轉錄水平以及整個腫瘤微環境的改變。對此，作者針對性地分析了在Nivo治療之後，黑色素瘤中基因表達水平的改變。結果顯示，475個基因存在顯著表達差異，並且這些基因中大多數與免疫調控相關。同時，眾多免疫檢查位點相關基因的表達也發生上調。而對於發生表達下調的基因，則大多屬於腫瘤生長通路上的基因，包括神經黑色素通路、細胞周期調控、有絲分裂以及翻譯過程等。另外，作者也觀察到了跟治療相關的一些細胞改變，如CD8+ T細胞和NK細胞數目發生明顯增加，而M1型巨噬細胞數目則發生下降（圖4）。

圖4. Nivo藥物治療後不同基因表達量的改變情況

黑色素瘤的瘤內T細胞的丰度、活性以及多樣性分析

接下來，研究人員想要去了解T細胞在使用Nivo藥物之後的動態變化過程， 因此使用了高通量測序技術，針對性地對T細胞受體（TCR）的β鏈上的互補決定區（CDR3區）進行深度測序。使用的樣本為Nivo藥物處理前的腫瘤樣品以及處理四周後的腫瘤樣品。

結果發現，腫瘤浸潤性淋巴細胞的比例出現提高，而這與免疫組化的實驗結果相一致。與此同時，作者使用了richness，evenness兩種多樣性評估指數進行樣本多樣性評價，發現其多樣性存在改變。並且，與是否使用過ipilimumab（Ipi）進行治療有關。另外，為了進一步確定T細胞受體的抗原結合能力，作者緊接著分析了抗體中V基因與J基因的組合類型，結果發現治療中的非Ipi治療患者其V、J基因組合的多樣性指數要顯著降低。以上結果表明：T細胞群體的多樣性變化，更多的是由其CDR3區上的氨基酸序列所決定的，即抗原識別特性（圖5）。

圖5. T細胞的多樣性動態變化與Nivo藥物處理有關

最後，作者通過評估T細胞群體的分布改變與腫瘤突變克隆的響應，預測新抗原丟失數目與T細胞克隆擴增數目之間的關係。發現T細胞克隆的動態變化跟腫瘤克隆動力學存在關聯。此外，作者通過計算新抗原比例發現：抗原突變的產生受到一定的選擇壓力。以上結果暗示，T細胞能夠有效地清除腫瘤細胞表達的新抗原免疫原性（圖6）。

圖6. 新抗原量消耗的同時T細胞數目發生成比例增加

總結討論

研究人員通過將多種組學研究方法相結合的手段，對實施抗PD-1療法的黑色素瘤患者進行全方位、多維度的腫瘤基因組以及腫瘤微環境改變的深入探究。該研究結果有利於剖析免疫檢查位點抑製劑的作用機理，並且為今後免疫檢查位點的研究與設計工作打下基礎。

參考文獻：

1. Borghaei H, Pazares L, Horn L, et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.[J]. New England Journal of Medicine, 2015, 373(2):123.

2. Herbst R S, Soria J C, Kowanetz M, et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature, 2014, 515(7528):563-7.

3. Taube J M, Anders R A, Young G D, et al. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Science Translational Medicine, 2012, 4(127):127ra37.

4. Joyce J A, Fearon D T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science, 2015, 348(6230):74.

5. Riaz N, Havel J J, Makarov V, et al. Tumor and Microenvironment Evolution during Immunotherapy with Nivolumab. Cell, 2017, 171(4):934.

本文章由華銀健康供稿

華銀健康合作客戶免疫組庫測序文章：

Chen et al. High-throughput T cell receptor sequencing reveals distinct repertoires between tumor and adjacent non-tumor tissues in HBV-associated HCC. OncoImmunology, 2016.（IF=7.719）

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