Bioconductor的DNA甲基化晶元分析流程

一次偶然的搜索中發現biocondutor有個甲基化晶元的分析流程，剛好可以學習下，寫的真的很棒。

Bioconductor的DNA methylation workflow可以在http://www.bioconductor.org/help/workflows/methylationArrayAnalysis/中查看，教程開頭先對DNA甲基化晶元及其原理做了簡單的介紹，包括一些常見的術語：比如β value和M value，後面就正式進入DNA甲基化的分析方法的講解了。

下載測試數據

測試數據是放在中的，安裝官網的方法安裝下即可（PS.如果安裝時卡住，可以用Rstudio的Tools來安裝）

安裝後，比如我R包是默認安裝的R文件夾中的，所以我的數據路徑是，那麼可以列出該目錄下有哪些文件看看

測試數據總共有兩套數據（GSE49667和GSE51180），前者總共包括10個樣本，作為主要的測試數據；後者則只用了其一個樣本，作為測試數據中的異常樣本。樣本分組信息：從3個體（M28, M29, M30）中取4種不同的T-cell types（naive, rTreg, act_naive, act_rTreg），act_naive、act_rTreg是指對應經anti-CD3、anti-CD28 antibodies處理的naive、rTreg，以上分組信息也可以看數據目錄下的文件

作者提了最近幾年常見的DNA甲基化晶元分析的軟體，如，，，，和，最後還提到了用來做差異甲基化位點分析

讀入數據

先按照教程載入其所會用到的R包

其中，，，，是DNA甲基化分析專用R包，，是用於可視化的R包，，是用於一些數據處理的，則是用於差異甲基化分析的

用包的函數讀入IDAT格式的數據，其中文件是必須的，不然最後數據集中會缺少樣本信息；其產生的targets向量中包含了樣本信息外，還有IDAT格式數據的所在路徑，方便函數讀入數據

質控

以detection p-values評估每樣本中的每個CpG位點的質量，當p-values > 0.01時則說明該探針信號數據質量較低，需要去除

將平均detection p-values > 0.05的樣本認為是低質量的樣本；從結果中可以看出最後一個樣本的平均detection p-values遠遠大於0.05，因此從中去除（從的結構中看出，其數據分布是按照每列一個樣本來的）

標準化

現在有很多用於DNA甲基化晶元數據的標準化方法，其中一些方法已經整合在包中了；現在為止沒有一種標準化方法被認為是最好的方法，但是一些標準化方法在某些情況下是比較好的選擇，作者總結了如下幾點：

除了上述提的2個標準化方法外，包還支持（類似於Illumina的Genome Studio的標準化方法），（Subset-quantile within array normalisation）以及（normal-exponential out-of-band）

作者比較了這些標準化方法後，發現對於這次的測試數據，這幾種標準化結果都大體上相似的，所以作者最終選擇了用，標準化為rgSet從對象變成了mSetSq的對象，表示從探針的信號強度轉化到了beta value/M value，並且已mapping to Genome

我們也可以不做任何標準化處理，只為獲得對象用於下游分析

然後用包內置的函數，看看標準化前後的beta value的密度曲線

Data exploration

作者建議可以先做個主成分分析，如Multi-dimensional scaling (MDS) plots來看下樣本分布情況，可以根據情況自行選擇向量中的分組，如看下下的MDS plot，PS.這裡是用M value來作圖的

數據過濾

一些質量較差的探針需要在下游差異分析之前去除，之前的質控作者是用detection p-value去除了異常樣本，在這裡則需要去除在一些樣本中質量較差的探針

做完上述過濾和標準化後，作者建議再看下MDS plot，看看樣本之間的聯繫是否發生了改變。對這個測試數據而言，第一個主成分上樣本不像之前那麼集中了，作者懷疑是由於去除了SNP關聯的探針的緣故

作者使用包的和來分別計算M-values和Beta-values，作者認為M-values具有更好的統計特性，更適合用於進行下游的統計分析（差異分析等）；而Beta-values更加容易解釋，更能說明生物學上的意義

並對兩者分別做了密度分布圖

差異甲基化分析

作者選了M-values作為後續分析的矩陣，對於差異甲基化位點的分析，作者沒有用包的函數，而是用了包的linear model來分析。所以按照的分析思路：

除了差異甲基化位點分析，作者還提了怎麼進行DMR（Differential Methylation Regions）分析；作者總結了幾個可用來DMR分析的bioconductor包，如：包的函數，包的函數。由於作者覺得函數運算速度過慢，除非使用多線程並行運算（如包），所以選擇用函數；並且由於這個函數也是基於，所以可以直接使用上面的和

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