克隆獼猴背後——系統生物學與表觀遺傳學的優美二重奏
這幾天一則和中國生命科學界有關的重大新聞登上了各類媒體科技版面頭條——中國科學家首次成功克隆了非人靈長類動物食蟹獼猴。儘管克隆技術已經不再如當年那樣充滿了新奇意味，但成功克隆靈長類動物仍然對於基礎科學、醫學、藥學研究有不可替代的重大意義。
藉由這個生命科學領域大事件，我們希望2018年重啟科協塵封的海星社計劃，帶領大學生跟蹤最前沿的科技進展，從中挖掘特別具有啟發意義的經典研究，建立生命科學相關專業的大學生課外交流討論平台。我們將關注有科學史意義、有科學發展風向標性質的科研事件，為感興趣的同學提供一個能夠沉浸於純科學樂趣的空間。
圖1. 中國科學家2018年1月宣布成功克隆非人靈長類動物食蟹獼猴，並以「中中」「華華」命名。Science雜誌評價這一成果為『The feat is a first for nonhuman primates』——第一次克隆非人靈長類動物的壯舉。（圖片來源：Science）
克隆技術我們並不陌生，大眾眼中的克隆技術主要指體細胞核移植克隆技術，這項技術第一次進入公眾視野，可以追溯到21年前。1996年7月，英國愛丁堡羅斯林研究所成功克隆了第一種哺乳動物——在蘇格蘭田間地頭隨處可見的綿羊。該成果於1997年一經披露就引起了公眾極大興趣，甚至成為20世紀末生命科學研究最重要的象徵符號之一。
在隨後的20年中，有23種哺乳動物先後被成功克隆。其中，與人類親緣關係最近，同時也是人類疾病研究最重要的模式動物種類之一的靈長類卻經歷了多次失敗。針對猴類的克隆面臨的一大難題在於克隆胚胎無法正常發育，而中國科學家這次通過應用近年來湧現的多種技術手段解決了這一難題，完成了猴類克隆的壯舉。
表1. 多種哺乳動物先後被成功克隆的時間[1]
引子
本月，中科院神經所孫強團隊在《Cell》雜誌撰文Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer，成功克隆。論文介紹了取得突破的兩個關鍵因素:
1、 全面優化的體細胞核移植操作技術
2、 採用國際上最新的胚胎細胞重編程技術
其中，最引人注目的是關於胚胎細胞重編程的技術應用。在文章摘要中，首先提到了將H3K9me3 脫甲基酶Kdm4d mRNA注入1細胞期克隆胚胎的重要操作，這一技術的運用起到了促使體細胞核移植胚胎成功發育的關鍵作用。而這項技術來自近年來十分熱門的系統生物學與表觀遺傳學進展，可以說是這兩個學科成果實際應用的經典範例，堪稱系統生物學與表觀遺傳學的優美二重奏。
要聆聽這段旋律，我們溯著時間回到2014年，哈佛大學Zhang Yi團隊在《Cell》上刊發文章Embryonic Development following Somatic Cell Nuclear Transfer Impeded by Persisting Histone Methylation。這項研究極其出色，其理論和技術可說是成功克隆非人靈長類的鑰匙。
SCNT的起伏命運
在講故事之前，我們先了解一下這項研究的背景。
體細胞核移植的英文全稱是Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)，自多利羊誕生以來，在中學課本里都能了解到這一技術的概貌，其核心操作步驟是將體細胞的細胞核移植到無核生殖細胞中，這樣的細胞能夠發育成帶有細胞核供體生物核基因組的新生物個體。這一過程涉及到如何讓已經分化的體細胞的細胞核重新回到分化前的狀態。我們知道，細胞分化的本質並不是基因組序列信息的增刪，而是基因的時空差異性表達。如果把基因組理解為一塊預裝了操作系統和軟體的硬碟，那麼同一生物個體內大部分不同類型的細胞是對遺傳信息的「打開方式」不同，可以理解為運行了不同的程序，進而實現多樣的生物學功能。那麼當一個已經分化的細胞經歷去分化過程，重新獲得分化潛力，就如同關閉了正在運行的程序，重啟了系統一樣，這樣的過程被科學家形象地稱為「re-programming」(重編程)。
圖2. 1996年誕生於英國愛丁堡的克隆羊Dolly是第一個被成功克隆的哺乳動物個體。（圖片來源：BBSRC）克隆技術之父John Gurdon畢業於著名的伊頓公學，右圖展示了他當時獲得的老師評語："..I believe he has ideas about becoming a scientist; on his present showing this is quite ridiculous…" （Photo by Sir John B. Gurdon）
在多利羊帶熱克隆技術至今的近20年中，對體細胞進行重新編程而獲得多能性幹細胞最著名的研究，是由日本科學家山中伸彌（Yamanaka Shin"ya）實現的誘導性多能幹細胞（Induced Pluripotent Stem Cell - iPS）, 以山中伸彌團隊為主的多國合作團隊經過長期艱苦的探索，最終發現僅通過調節4種關鍵轉錄因子（山中因子Yamanaka factors）在細胞中的水平，就足以將體細胞重編程為具有強大分化能力的誘導性多能幹細胞，這一成果2006年一面世就被認為具有劃時代意義。2012年，山中伸彌和體細胞核移植技術的發明人約翰·伯特蘭·格登爵士(Sir John Bertrand Gurdon)共享了諾貝爾生理學或醫學獎。
與公眾對體細胞核移植技術的想像不同，SCNT的主要價值除了通過無性方式「複製」動物，在人類層面的應用主要與幹細胞來源有關。多能性幹細胞具備強大的分化潛力，有望甚至部分已經被運用於器官再生、組織修復等具有重大醫學價值的領域。因此如何獲得可靠的、與患者體細胞遺傳背景相同的幹細胞成為一個熱門研究領域，實際上，通過SCNT製備的胚泡（Blastocyst）是多能性幹細胞的重要來源，而未必需要讓其繼續發育過程。
SCNT在iPS技術面世後一度不被看好，與iPS更加直接的製備方式相比，SCNT不但耗時費力，而且還存在更突出的倫理問題。然而這一局面到2013年開始出現了轉機。
隨著2013年俄勒岡健康與科學大學的Shoukhrat Mitalipov團隊首次公布利用人類體細胞核移植製備胚胎幹細胞成功，寶貴的人類多能性幹細胞有了兩種熱門的製備方式： iPS與SCNT[2]。
2014年，俄勒岡健康與科學大學的同一團隊、加州大學聖地亞哥分校、Salk生物研究所等多家機構的聯合團隊在《Nature》發文，發現分別來源於iPS與SCNT的人類多能性幹細胞存在差異：來自人類體細胞核移植製備的多能性幹細胞在DNA甲基化模式和基因表達模式方面更加接近取自體外受精胚胎的人類胚胎幹細胞[3]。這項研究製備了多個iPS和SCNT幹細胞系，分別與人類胚胎幹細胞、體細胞進行了系統生物學對比，結果證明，iPS在「去分化」的程度上似乎不如SCNT製備的幹細胞「徹底」。由此，通過體細胞核移植技術製備人類多能性幹細胞成為一個重要的研究方向。
圖3. 在多個表觀遺傳學和系統生物學測試中，iPS在「去分化」的程度上均呈現出不如SCNT來源幹細胞「徹底」的現象。圖中展示了印記基因的甲基化分析，左邊標出了不同印記基因的名稱，熱圖中的顏色代表了各個細胞系相應基因甲基化的程度，可以直觀看出，SCNT來源的幹細胞與取自人工受精胚胎的幹細胞有著更加接近的印記基因甲基化模式[3]。因為篇幅關係，我們這次先不介紹印記基因以及印記基因與胚胎髮育之間的有趣關係。不過印記基因是非常有趣的表觀遺傳學現象，我們可以另找機會交流這一領域。
豐滿理想與骨感現實
與人們的美好願望相伴的，是包括人類在內的哺乳動物體細胞核移植低下的胚胎髮育成功率。在已經克隆的哺乳動物中，成功率最高的牛也僅有5%到20%的胚胎可以正常發育至分娩，而其它20餘種哺乳動物的胚胎髮育成功率僅有2% ~ 3%[1]，我們最關心的人類克隆胚胎，僅有10%到25%能夠發育到囊胚期[2, 4]，低下的發育成功率成為制約體細胞核移植技術應用的關鍵問題。
為了釐清原因並解決這個問題，科學家進行了不懈的探索，簡要地說，這些發育失敗可以籠統地歸結為體細胞核進入去核生殖細胞後「去分化不完全」和「重編程不完全」，這些沒能成功去分化和重編程的細胞往往出現各種發育異常。
其中，有一個特殊的環節引起了人們重視，很早科學家就定義了一個胚胎髮育過程中的關鍵環節——母型-合子型過渡（ Maternal to Zygotic Transition (MZT)），看起來很高深的一個術語，實際上簡單理解起來，是指受精卵開始分裂的階段，伴隨著細胞內多種mRNA和蛋白質濃度顯著變化的過程，這個過程是新產生的受精卵細胞核開始運作，開始接管整個受精卵的生命活動、轉錄翻譯出新的RNA及蛋白質並取代卵子細胞質原有轉錄翻譯產物的過程。這個過程既有合子基因組的激活（Zygotic Genome Activation (ZGA)），也伴隨著卵子原有轉錄翻譯產物的降解。
圖4 . 母型-合子型過渡(MZT)過程中，存在著細胞中原有卵子細胞質物質降解和合子基因組激活並接管細胞的過程[5]。
對於哺乳動物克隆而言，問題常常也發生在這個環節，多種哺乳動物的克隆過程中，胚胎髮育失敗常出現在核移植細胞類似於合子基因組激活的關鍵階段——體細胞細胞核攜帶的基因組有很大概率無法像正常受精卵的基因組一樣工作。
科學家綜合眾多研究成果發現，那些無法發育成囊胚的體細胞核移植胚胎細胞可能存在多種「表觀遺傳屏障」阻礙基因組的重編程和激活[6]。這話題也牽扯出表觀遺傳修飾現象與哺乳動物克隆之間長達數十年的「恩恩怨怨」——我們今後有時間再去談那些故事。
今天，科學研究已經揭示，自然受精的受精卵在發育過程中會經歷多次自發的大規模表觀遺傳修飾重建過程，這種重建過程的作用和意義牽涉甚廣。其中一個可能的作用是暫時性消除表觀遺傳屏障，為受精卵發育掃清障礙。
回到我們要講的故事，這裡的「表觀遺傳屏障」，是指體細胞基因組和染色質上存在諸如DNA甲基化、組蛋白修飾一類的表觀遺傳修飾，阻礙體細胞核移植之後的細胞重編程，進而阻礙克隆胚胎髮育，特別是阻礙體細胞核進入去核生殖細胞後的基因組激活過程。這種表觀遺傳修飾造成了許多克隆胚胎無法順利發育過2細胞期。
要想解決這類困難，就需要理清幾個問題：
1、 哪些基因的表觀遺傳修飾造成了這一後果？
2、 什麼樣的分子機制控制基因組重編程過程？
3、 是否有方法可以介入這一調控機制？
圍繞上述問題，哈佛大學Zhang Yi團隊展開了一系列卓有成效的工作，最終為非人靈長類動物的克隆貢獻了關鍵技術。
表觀遺傳修飾與體細胞的「重編程抵抗」
故事是從關於克隆胚胎和受精產生的胚胎有什麼區別這一問題開始的。
不難想像，對於細胞核還未接管細胞運作的核移植細胞或受精卵而言，細胞中的大部分RNA都來自卵母細胞或卵細胞「自帶」的轉錄產物，這種一群細胞或一個細胞中轉錄產物的總和，我們把它們叫做轉錄組（Transcriptome）。對於體細胞核移植胚胎的細胞而言，這個時期細胞中的轉錄產物無論在組成上還是量上，都應該和剛剛受精的受精卵類似。而一旦合子基因組激活(ZGA)啟動，受精卵的轉錄產物成分和濃度就會發生顯著變化，而體細胞核移植胚胎細胞如果沒能成功激活基因組，就會繼續維持或部分維持原本的轉錄組狀態，從而在轉錄組水平上與發育中的受精卵產生明顯差異。
為了驗證克隆細胞的這個合子基因組激活應該發生卻沒有成功完成的發育節點，同時研究有哪些基因的表達在合子基因組激活過程中發生了變化。Zhang Yi團隊在小鼠克隆胚胎和人工受精胚胎上使用了名為RNA-Seq的系統生物學技術。
RNA-Seq可以被翻譯為RNA測序，但全稱是全轉錄物組鳥槍法測序 Whole Transcriptome Shotgun Sequencing，是系統生物學研究轉錄組的常見以及重要手段。理論上，RNA-Seq可以測定目標細胞中特定時間點所有RNA的種類和量。
從上述那個拗口的全稱中，大概可以看出這種技術的原理。細胞中的所有RNA被從細胞中提取以後，經過片段化處理和篩選（例如分離出mRNA），再被集體逆轉錄為DNA。對這樣的混合短DNA分子樣品進行高通量測序，就可以間接得到所有mRNA分子的序列，由於不同種類的mRNA分子濃度不同，因此各mRNA對應的片段化後的逆轉錄產物DNA分子的數量也不同，通過對DNA分子高通量測序結果的計算、比對和統計，就可以識別出哪些序列被測序讀取的次數高，哪些次數低。將這些測序結果對應到參考基因組序列上，就可以推知正在轉錄的基因以及它們轉錄出的RNA的量（圖5）。
圖5. RNA-Seq的基本原理圖解（圖片來源：維基百科）
圖6[7]. A，IVF胚胎髮育和SCNT胚胎髮育過程示意圖。圖BC，RNA-seq對基因活動的定量測定結果，圖中每個點可視為一個基因，其對應的橫坐標值和縱坐標值分別代表了這個基因在SCNT胚胎細胞和IVF胚胎細胞中的表達水平。如果在兩種細胞中，某個基因的表達水平相同或接近，那麼這個點應該分布在散點圖的對角線上（或靠近對角線的區域），如果某個基因的表達水平在兩種細胞中顯著不同，則點的位置會顯著偏離對角線區域。圖B為1細胞期兩種細胞的測定結果，圖C為2細胞期兩種細胞的測定結果。可以看出在2細胞期，SCNT胚胎細胞和IVF胚胎細胞中行為不同的基因數量大增，意味著兩種細胞的行為差異變大。圖中出現的FPKM（Fragments Per Kilobase Million）是一種常見的RNA-seq轉錄本轉錄水平的度量單位，計算方法是把每個基因對應的測序結果計數除以基因長度（單位長度基因片段對應的測序片段數量），再除以對比成功的所有測序結果的總數，由此得到一個可在一個實驗的數據集內相互比較的相對基因轉錄水平。
在這項研究中，研究人員對小鼠人工受精胚胎（IVF Embryos）的細胞、體細胞核移植胚胎(SCNT Embryos)的細胞分別取了兩個時間節點進行RNA-Seq實驗，一個時間點是1細胞期，一個時間點是2細胞期後期。RNA-Seq在上述實驗中，從每個樣本都讀取了超過3000萬個短序列並通過分析軟體對應到參考基因組序列上。
對於1細胞期的兩組樣品，共有5517個基因被探測到轉錄活動，而其中只有106個基因在兩種細胞（Cells from IVF Embryos and SCNT Embryos）中轉錄水平差異達到3倍以上（圖6B），這意味著這兩種細胞在胚胎髮育的這一階段，其基因組行為是十分接近的。
而對於2細胞期的兩組樣品，則結果大為不同，轉錄水平差異達到3倍以上的基因猛增到1212個(圖6C)，這意味著體細胞核移植克隆胚胎的細胞在2細胞期的發育中由於某種原因，無法像人工受精的胚胎細胞那樣進行生物學活動。
進一步對這些數據進行分析，就得到了由RNA-seq數據計算得出的熱圖，這類圖譜的樣子在當今的生物學研究中非常常見，特別是系統生物學研究（圖6D）。這幅熱圖展示並比較了三種細胞在2細胞期的RNA-seq結果，來自以千萬計的測序反應的序列數據。這三種細胞分別是細胞核供體細胞（卵丘細胞）(Donor)、核移植胚胎細胞(SCNT)、人工受精胚胎細胞(IVF)。如圖所示，將細胞核供體細胞的基因按照轉錄水平的變化歸類排布，再將SCNT細胞和IVF細胞的相應基因以相同的順序排列在右側，則通過顏色表示的相對轉錄水平就可以輕易展示哪些基因在三種細胞之間發生了顯著的行為變化。
這項工作識別到了3775個在體細胞與兩種胚胎細胞之間表達水平存在顯著差別的基因，並按照它們差異的規律劃分為5類。其中的1549個基因（Group 1, 2）在核移植胚胎細胞(SCNT)、人工受精胚胎細胞（IVF）中都被顯著激活。而這些基因主要與細胞周期相關的生物過程有關，比如細胞周期調控、DNA合成、DNA修復等等。說明核移植(SCNT)胚胎細胞與人工受精（IVF）胚胎細胞一樣，在2細胞期為細胞分裂做好了準備。還有許多原本在體細胞中活躍的基因則在核移植(SCNT)胚胎細胞、人工受精（IVF）胚胎細胞都發生了沉默（Group 4），這些基因主要與細胞的代謝活動有關，比如脂質合成、電子傳遞鏈等等，說明體細胞核在移植後終止了這些基因的轉錄，暫時降低或關閉了這類生命活動相關的基因表達。
而有趣的是那些在核移植(SCNT)胚胎細胞、人工受精（IVF）胚胎細胞中呈現不同狀態的基因（Group 3, 5）。其中Group 5的372個基因在體細胞核移植後沒有像人工受精（IVF）胚胎細胞那樣處於關閉或低表達狀態。而Group 3的301個基因則沒能在體細胞核移植後像人工受精胚胎細胞那樣處於適當激活狀態。其中最引人注目的是本該在這一發育階段處於激活狀態的Group 3的基因，主要與核糖體合成、轉錄、RNA加工、RNA剪接、mRNA的轉運有關。這些基因沒能被激活，很有可能表明體細胞核移植胚胎在這一時期存在基因表達和基因表達調控方面的障礙，導致無法像人工受精的胚胎一樣順利發育。
圖6[7]. D，RNA-seq數據分析熱圖。E，細胞間行為差異顯著的基因被歸類。
經過RNA-seq這樣一種強有力的高通量系統生物學手段，由此Zhang Yi團隊了解了兩個重要事實：
1、克隆胚胎細胞和人工受精胚胎細胞相比，基因組行為主要的區別發生在2細胞期。
2、克隆胚胎髮育成功率低下的原因很有可能與Group 3基因在2細胞期激活失敗有關。
下一步，就是找出阻礙這些基因激活的關鍵因素。
為了進一步研究這個問題，Zhang Yi團隊識別、劃分出了811個長度不等的基因組區域，這些區域都有一個共同特點：在人工受精胚胎細胞中，被發現在1細胞期到2細胞期的發育過程中被激活。其中342個區域在體細胞核移植胚胎細胞中也被激活，因此他們把這些基因組區域稱為完全重編程區段（Fully Reprogrammed Regions (FRRs)），而247個區域在體細胞核移植胚胎細胞中只被部分地激活，因此被稱為部分重編程區段（Partially Reprogrammed Regions (PRRs)），最後，還有222個區域是在體細胞核移植胚胎細胞中本該激活卻未能被激活的，被命名為抗重編程區段Reprogramming Resistant Regions (RRRs)。這些區域在基因組上被標示出來，成為造成體細胞核移植胚胎髮育失敗的「嫌疑區域」。
那麼為什麼體細胞基因組上的RRRs在克隆過程中如此難以被激活呢？
這時候Zhang Yi團隊想到了和克隆技術「恩怨」頗深的表觀遺傳修飾問題，也就是我們一開始提到的「表觀遺傳屏障」。會不會就是體細胞染色質和基因組上的表觀遺傳修飾阻礙了這些「頑固區域」的激活呢？——科學家認為可能性很大。
為了照顧大三以下的同學，我們在這裡簡單介紹一下表觀遺傳和組蛋白修飾的問題。表觀遺傳（Epigenetics）是當今生命科學的研究熱點之一，並且已經持續火熱了數十年，依然後勁十足。
表觀遺傳這個詞，單從中文翻譯而言，很難直觀理解，但又沒有更達意的翻譯。在英文中，表觀遺傳和後生論（Epigenesis）在詞源上顯然關係密切。要很好地理解表觀遺傳的概念，我們需要穿越到大約400年前，那個時代對於基因等等概念都一無所知，人們對生物發育的理解各不相同，其中最著名的問題就是預成論和後生論的爭議。預成論認為受精卵基本已經具備了成體的各種特徵，發育過程更接近簡單的生長過程（比如合子中存在一個肉眼看不見的小人，在懷孕過程中不斷長大）。後生論則認為發育過程是伴隨著連續不斷的特徵變化的過程（合子與成體的特徵不同）。
大約400年前的英國醫生、生理學家及胚胎學家威廉哈維William Harvey提出了後生論（漸成論Epigenesis）來定義這一類觀點，這成為哈維繼心血運動論之外又一個被寫進中國當今中學生物課本的重大理論概念。後生論被提出的那一年，明朝崇禎帝即位。
與幾百年前的概念不同但又類似地，在遺傳學被建立以來，也曾存在兩種觀念的碰撞：一種認為生物的可遺傳表型全部來自基因的編碼，是生而就決定好的，後天獲得的生理特徵不會被遺傳，這基本符合高中生物學對拉馬克主義的批判；另一種認為環境作用或基因序列以外的因素也可以造成可遺傳的表型。為了描述後一種觀念，大約在抗日戰爭時期，受Epigenesis（後生論）的啟發，表觀遺傳（Epigenetics）被提了出來，那個時候，DNA雙螺旋還沒有被發現，人們並不清楚基因具體如何工作，只是發現有許多不符合孟德爾遺傳的現象，其中有一些可遺傳性狀可能與環境有關（某種「後生性」，基因因素以外的，後天獲得的）。但在之後的半個世紀，伴隨著基因的本質被發現，表觀遺傳（Epigenetics）的概念引起了曠日持久的爭議和混亂定義，但好在隨著表觀遺傳現象的分子機制陸續被研究出來，直到北京奧運那一年，Epigenetics才有了比較統一的定義：不由DNA序列改變而形成可遺傳表型的遺傳現象。
或許，結合上面的歷史故事，將Epigenetics翻譯成「後生遺傳學」更容易讓人們理解這個詞的「內涵」。
真相浮現，新技術打破表觀遺傳屏障
回到我們的故事，不改變DNA序列，產生的表型又可遺傳，其中兩種分子生物學機制就是組蛋白的化學修飾和DNA甲基化。真核生物的DNA纏繞在組蛋白上，形成核小體，這種結構可以控制基因的行為。組蛋白如果被特定化學基團修飾，就有可能改變核小體和基因的表達水平和活性狀態。這種組蛋白修飾在真核基因組中普遍存在，甚至形成除DNA序列之外的另一種編碼系統，調控細胞的基因組和染色質行為。
圖7. 組蛋白的修飾可以調節真核細胞的基因組和染色質行為（圖片來自：promega）
Zhang Yi團隊考慮到當時只有少數小鼠體細胞已經有了完整的組蛋白修飾數據集，而其中小鼠胚胎成纖維細胞是克隆技術常用的體細胞核供體，並且也面臨著克隆胚胎髮育障礙的困擾。因此科學家們假定，如果克隆胚胎的發育失敗真的與組蛋白修飾等表觀遺傳修飾有關，那麼小鼠胚胎成纖維細胞的組蛋白修飾位置可能也和RRRs存在關聯。
那麼Zhang Yi團隊發現的RRRs區域是否和某種特定的組蛋白修飾有關呢？通過利用小鼠胚胎成纖維細胞的組蛋白修飾數據集進行分析發現，H3K9me3（組蛋白H3，9號位點賴氨酸三甲基化）修飾與RRRs之間存在明顯的對應關係（圖8）。既然鎖定了目標，很快Zhang Yi團隊就針對H3K9me3這種組蛋白修飾調取了其它幾種體細胞的染色質免疫共沉澱測序ChIP-seq數據（簡單來說就是一種在從基因組中尋找、標記H3K9me3的技術，主要方法是用抗體特異性地「抓取」 與H3K9me3相互作用的DNA片段進行測序），發現這種對應關係廣泛存在於多種體細胞基因組上，符合之前假定的這種「表觀遺傳屏障」在體細胞中的普遍性。
H3K9me3通常被認為與異染色質有關，這也可以解釋為什麼RRRs中的基因難以被激活，這些基因有可能被染色質的狀態「禁錮」了。通常情況下，活躍的染色質區段結構比較鬆散，其DNA更容易被DNA內切酶切斷，而異染色質區域則對DNA內切酶不敏感。為了驗證這種想法，Zhang Yi團隊又調取了幾種體細胞的DNA酶I超敏感性位點數據，發現RRRs確實對DNA酶I不敏感。
圖8[7]. 通過對比常見組蛋白修飾數據集與三種重編程區域的關係，可以發現H3K9me3與RRRs之間關係密切。
研究到這裡，可見體細胞核移植胚胎的細胞，無法像人工受精胚胎的細胞一樣在2細胞期被正常激活一些重要基因組區域。主要原因是在體細胞中，這些染色質區域被H3K9me3這種組蛋白修飾「禁錮」於一種有異染色質特徵的狀態，從而造成基因無法被激活。
如何處理這種棘手局面呢？
最直接的方法是移除H3K9me3，看看能不能促進體細胞核移植胚胎細胞的重編程。Zhang Yi團隊將編碼『H3K9me3特異性去甲基化酶（Kdm4d）』的mRNA直接注入了體細胞核移植早期胚胎細胞(圖9A)，並在1細胞期和2細胞期分別測定了H3K9me3的存在情況。免疫染色很清楚地顯示Kdm4d確實移除了胚胎細胞染色質的H3K9me3（圖9B）。
在實驗設計上，這個實驗特別值得科研新人學習的是其對照組設計（圖9B），除了沒有注射Kdm4d mRNA的對照組，還有一個注射了突變的無功能Kdm4d mRNA的對照組，這個對照組非常關鍵，可以證明H3K9me3的消失確實是因為Kdm4d 的活性，而不是因為mRNA注射操作或其它實驗因素造成的結果。
圖9[7]. 非常值得新人學習的對照組設置
那麼既然H3K9me3被確實被移除了，體細胞核移植胚胎細胞是否被重編程，其上的基因是否繼而被激活呢？Zhang Yi團隊再次進行了RNA-seq，這一次，結果表明，222個RRRs區域中，184（83%）個區域在Kdm4d mRNA注射後被激活，而突變的無功能Kdm4d mRNA則無法達成這一結果。說明Kdm4d 的活性確實激活了這些RRRs區域。而且不僅是RRRs區域，之前識別到的1212個在核移植胚胎細胞(SCNT)與人工受精胚胎細胞(IVF)中表達水平差異顯著的基因，下降到了475個。Kdm4d mRNA注射顯著提高了核移植胚胎細胞(SCNT)與人工受精胚胎細胞(IVF)在2細胞期的相似性。
既然利用人工注入特異性去甲基化酶的mRNA已經在很大程度上克服了體細胞核移植胚胎髮育早期的「表觀遺傳屏障」，是否這些胚胎的發育成功率能夠被提高？
進一步的實驗證明了這一技術的驚人效果。在沒有接受注射的體細胞核移植胚胎中，只有26.0%的胚胎在第一次分裂後繼續發育到囊胚階段。而接受了Kdm4d mRNA注射的胚胎這一比例提高到了令人吃驚的88.6%（圖10A）。對於其他體細胞核供體塞爾托利氏細胞（Sertoli,睾丸營養細胞）和小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）來源的克隆細胞也有相似效果。
圖10[7]. 多種不同體細胞作為細胞核供體製備的克隆胚胎，在經過Kdm4d mRNA注射之後，發育成功率均顯著提升。
同樣的，如果將這種經過mRNA注射的2細胞期胚胎植入假孕雌性小鼠的輸卵管，則著床率比對照組提高了3倍。而發育到了預產期的比例由對照組的0%提高到了經Kdm4d mRNA注射胚胎的7.6%。而這些胚胎經過Kdm4d mRNA注射輔助發育的克隆小鼠，可以正常發育至成年、交配併產生後代。
Zhang Yi團隊在隨後的實驗中發現體細胞中三種組蛋白賴氨酸甲基轉移酶Suv39h1, Suv39h2, Setdb1構建了體細胞的RRRs表觀遺傳屏障，先使用RNAi（RNA干擾）技術「敲低」體細胞中這三種甲基轉移酶的濃度，再取體細胞核進行克隆，也可以大大提高小鼠克隆胚胎的發育成功率，並且Suv39h1/2起到了決定性的作用。
這項出色的研究揭示了包括人類在內的哺乳動物克隆難題背後普遍存在的關鍵障礙，並在此基礎上展示了一種全新技術，可以通過人工手段介入改造體細胞的表觀遺傳修飾，幫助體細胞核移植胚胎越過「表觀遺傳屏障」，大大提高克隆小鼠胚胎的發育成功率。
在2018年中國科學家公布的克隆長尾獼猴（食蟹獼猴）成果中，就採用了RRRs的概念並運用了Kdm4d mRNA注射方法來保障克隆猴胚胎髮育的成功率。
從哈佛大學Zhang Yi團隊的研究過程中，不難看出系統生物學方法在剖析、研究複雜生物系統過程中的強大能力，以及表觀遺傳效應對真核細胞，尤其是高等動物細胞基因組行為的巨大影響。由RRRs的發現到長尾獼猴的成功克隆，不能不說是系統生物學方法和表觀遺傳學研究的巨大成就。
能讀到這兒的人，應該是生命科學真愛。
歡迎通過科協聯繫魚山科協前沿瞭望撰稿人，就感興趣的話題進行交流。
我們留一個有趣的問題：表觀遺傳中有一類有趣的現象叫印記基因，在克隆羊誕生前，印記基因的存在曾經為哺乳動物克隆「判過死刑」。那麼什麼是印記基因？為什麼克隆哺乳動物曾被認為是不可能完成的任務？歡迎有興趣的同學來信討論，或參加科協的線下討論會。
下一期的主題來自一些近期發表的科研成果，關於病毒在進化過程中可能扮演的角色。
魚山科協
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5. Schultz, R.M., The molecular foundations of the maternal to zygotic transition in the preimplantation embryo. Human Reproduction Update, 2002. 8(4): p. 323-331.
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7. Matoba, S., et al., Embryonic Development following Somatic Cell Nuclear Transfer Impeded by Persisting Histone Methylation. Cell, 2014. 159(4): p. 884-895.
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