Hold住細胞興奮性！浙大康利軍組Neuron揭示致聾基因新機制——清華學者點評

跨膜離子通道樣蛋白TMC1的突變，會導致聽覺、前庭缺陷和人類家族遺傳性耳聾，但其功能和分子機制存在很大爭議。1月26日，浙江大學醫學院康利軍課題組在Neuron雜誌上發表了題為「TMC proteins modulate egg-laying and membrane excitability through a background leak conductance inC. elegans」的研究論文，揭示TMC-1和TMC-2可通過恆定的背景Na+電流，維持神經和肌肉細胞的靜息膜電位和興奮性，並調控相應的行為範式。這一發現不僅為闡明先天性耳聾的機制提供了新的線索，而且首次揭示了肌肉細胞中的興奮性背景鈉通道，為相關神經、肌肉系統疾病的診斷、治療和藥物開發奠定了科學基礎。鑒於該成果的重要意義，BioArt特別邀請到了從事聽覺相關研究的清華大學生命科學學院PI、青年千人熊巍研究員做精彩點點評，以饗讀者！

據統計，我國每1000個新生兒中有2～3名聾兒，其中一半以上的新生聾兒是由致聾基因突變導致的遺傳性耳聾。跨膜離子通道樣蛋白（TMC，Transmembrane channel–like proteins）是一類新型的離子通道樣蛋白家族。TMC1是內耳中聽毛細胞檢測聲波刺激所必須的組分，TMC1基因突變是家族遺傳性耳聾的常見病因【1】。最新Nature雜誌上發表的論文表明，通過CRISPR-Cas9基因編輯技術糾正Tmc1基因上的突變點，可以恢復突變小鼠的聽力【2】（詳見BioArt此前的報道：突破丨《自然》年度人物David Liu課題組運用基因編輯有望治療遺傳性耳聾）。先前文獻報道TMC1是聽毛細胞感受聲波刺激的機械敏感離子通道，然而此假說還缺乏實驗證實，也有報道認為TMC1跟高鹼感受和運動相關。TMC蛋白家族中其他蛋白的生理功能和作用機制一直以來也所知甚少。

在這項研究中，研究人員發現，TMC-1在秀麗線蟲神經、肌肉系統中廣泛表達，而TMC-2特異性表達於肌肉細胞中。 TMC-1和TMC-2的缺失，均會導致秀麗線蟲產卵行為缺陷。研究人員首先想到產卵行為跟機械感受之間可能存在密切的聯繫，也就是卵到達排卵部位後，可能對相關的神經元和肌肉組織產生擠壓作用，而這種擠壓力由什麼蛋白感受，先前未見報道。

通過構建表達有GCaMP5.0熒光蛋白的轉基因品系，以在體胞內鈣成像檢測，研究人員發現TMC蛋白對於維持卵孔肌肉細胞（VM）和HSN神經元的節律性鈣震蕩至關重要。而基於ChR2和CoChR轉基因的光遺傳實驗檢測，也進一步證明了這一論斷。

為了進一步探索TMC蛋白調控細胞興奮性的分子機理，康利軍課題組研究人員記錄並檢測了相關神經元和肌肉細胞的電生理特性。有意思的是，他們發現在tmc突變體中，VM 肌肉細胞、HSN神經元以及ASH神經元的靜息電位明顯偏低，細胞處於超極化狀態，因此其可興奮性均顯著降低。同時，這些細胞上的背景Na+漏電流（background Na+ leak current）都顯著減小。此外，TMC -1在ASI神經元（頭部感覺神經元）上的異位表達，則能顯著加大其背景Na+電流，並提升細胞的靜息膜電位，增強其可興奮性。

在接下來的研究中，研究人員發現以三環抗抑鬱葯丙米嗪（imiprimine）處理，抑制肌細胞上的背景K+通道(EAGK+)活性，或者基因敲除肌細胞上的UNC-103鉀通道，可以完全拯救恢復tmc基因突變體的行為缺陷（下圖）。這些結果表明，通過藥物或遺傳學方法調控與TMC蛋白功能相關的基因活性，就可恢復tmc基因突變體的缺陷表型。

圖1 調控K+離子通道活性可以拯救tmc基因突變體的行為缺陷

有意思的是，組織特異性過表達小鼠TMC1、 TMC2或人源TMC3 均可以拯救恢復tmc突變體線蟲在行為、鈣成像和電生理上的缺陷表型，表明哺乳動物類TMC基因和秀麗線蟲TMC具有進化上的保守性和類似功能機制。

這項研究首次揭示了TMC蛋白可通過背景Na+漏電流，維持細胞（神經元和肌肉）的膜電位，進而影響細胞本體興奮性，並調控相應的行為輸出，從而為早期診斷和治療遺傳性耳聾和其他相關神經肌肉系統疾病，提供了新的線索（下圖）。

據悉，浙江大學神經生物學博士生岳曉敏、趙劍、碩士生李笑為論文的共同第一作者。浙江大學醫學院神經科學研究所研究員康利軍博士和弗洛里達大學衰老研究所肖睿博士為本論文的共同通訊作者。

左到右依次是:岳曉敏、趙劍、康利軍老師、李笑

專家點評：

熊 巍（清華大學生命科學學院研究員，中組部「青年千人」入選者，基金委優秀青年科學基金獲得者。研究方向：聽覺毛細胞的機械敏感性及其聽覺通路對於聲音的調製；耳聾發生的致病機理和生物學治療）

Comments：在已經報道的100個左右的耳聾基因中，TMC1是最受人關注的，因為它被認為是聽覺機械感受的通道蛋白。自從2002年由Andrew Griffith實驗室和Karen Steel實驗室在Nature Genetics雜誌發表兩篇背靠背的論文，分別通過人的家系和小鼠遺傳學（一株名為貝多芬的顯性遺傳耳聾小鼠）的分析克隆到Tmc1基因以後，後續對它的功能研究將其定位為一個參與毛細胞發育的因子，直到2011年Jeffery Holt和Andrew Griffith實驗室在TMC1和TMC2雙敲除的小鼠上發現毛細胞的機械電流完全喪失， 2013年他們在Neuron雜誌進一步報道貝多芬突變小鼠毛細胞機械感受單通道電導變小（源於TMC1第3、4跨膜段的胞外loop上的一個氨基酸突變）【1】，因此推論TMC蛋白可能是毛細胞機械敏感的通道元件，但是TMC1是否是聽毛細胞中直接感受聲波刺激的機械敏感離子通道蛋白，其實並沒有被證實，為此2016年Jeffery Holt、David Corey和Ulrich Mueller在Journal of Neuroscience雜誌發表Dual Perspectives做過詳細討論【3】。同年（2016年）也有三篇針對TMC1的研究工作，表明其功能和機制的確撲朔迷離， Shawn Xu實驗室在Neuron雜誌報道TMC1 參與了線蟲ASH 感覺神經元介導的對高鹼的迴避反應【4】，Yuhnung Jan和王佐仁實驗室合作在PNAS雜誌報道了tmc基因參與果蠅幼蟲的運動控制，Craig Montell實驗室在Neuron雜誌報道在果蠅上tmc基因參與味覺感受。基於目前的這些研究成果，TMC蛋白的生理功能和作用機制，依然有待突破。

浙江大學康利軍課題組的這項研究，不同於以往的對TMC蛋白在感知功能方面的研究，這項研究利用多種神經科學技術手段，利用秀麗線蟲的遺傳學優勢，以線蟲的產卵行為為切入點揭示了TMC蛋白的新功能。他們發現tmc1和tmc2突變的線蟲存在產卵行為缺陷，而tmc1表達在和產卵行為相關的神經元和肌細胞上，tmc2隻表達相應的肌細胞上。通過藥物處理抑制肌細胞上的EAG K+通道活性，或者通過基因敲除拿掉肌細胞上的UNC-103鉀通道，都可以拯救恢復tmc基因突變導致的行為缺陷。這些結果提示TMC1/2介導恆定的背景Na+電流，可能作為第二類背景Na+通道蛋白，維持神經和肌肉細胞的靜息膜電位和興奮性，並調控相應的行為範式。

同時，過表達小鼠源或人源的TMC 均可以拯救恢復tmc突變體線蟲的缺陷表型，也表明哺乳動物類TMC基因和線蟲TMC具有進化上的保守性和類似功能機制。Tmc1基因突變可引起常染色體隱性(DFNB7/11)和常染色體顯性(DFNA36)非綜合征型耳聾，上個月David Liu和Zhengyi Chen發表於Nature的研究利用CRISPR-Cas9基因編輯策略在體清除Tmc1基因的顯性突變allele，實現顯著恢複雜合貝多芬小鼠的聽力喪失【2】。浙大康利軍組的研究為我們打開了一個了解TMC功能的全新視角，同時提示藥物或遺傳操作可能用來治療TMC缺陷造成的遺傳性疾病，為TMC相關的遺傳性疾病的診斷、治療和藥物研發提供了理論依據和研究模型。

參考文獻：

1、Pan et al., (2013). TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear.Neuron79, 504-515.

2、Gao et al., (2018). Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents.Nature553(7687):217-221.

3、Wu Gao et al., (2016). Molecular Identity of the Mechanotransduction Channel in Hair Cells: Not Quiet There Yet.J Neuroscience36(43):10927-10934.

4、Wang et al., (2016). TMC-1 Mediates Alkaline Sensation in C. elegans through Nociceptive Neurons.Neuron91(1):146-54.

康利軍教授簡介：

2006--2011年先後在德國Max-Planck生物物理與化學研究所、美國密歇根大學生命科學研究所從事博士後研究；2011年9月加盟浙江大學醫學院。主要研究觸覺、痛覺等感覺生成與衰老的分子（如機械敏感離子通道）和神經環路機制，以及神經膠質細胞的在體功能，探討感覺障礙、慢性痛和神經退行性疾病等神經精神疾病的分子病理，為藥物研發、臨床診斷與治療提供科學基礎。通訊作者論文發表於Neuron、Frontiers in Molecular Neuroscience和Lab Chip等國際學術期刊，其他研究成果發表於Cell、Cell Metabolism、Neuron、Nature Neuroscience、Nature Structural & Molecular Biology、Nature Communications和EMBO J等國際著名期刊。被Neuron、Nature Reviews Neuroscience、Faculty of 1000等著名期刊媒體配發評論。作為課題負責人研究課題有國家重大科學研究計劃、國家863計劃、國家自然科學基金面上項目和浙江省自然科學基金傑青項目等。

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