低密度脂蛋白膽固醇測定方法研究進程

摘要 血清或血漿中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）與冠心病（CDH）發生和動脈粥樣硬化損傷呈正相關，而且是美國國家膽固醇教育計劃（NCEP）作為脂類疾病分類和風險預測的一個重要指標。LDL-C也是選擇藥物治療和預後方面的一個十分有意義的臨床指標，國內外都在研究和開發行之有效、可靠的標準化測定方法。本文對其有關的測定方法和研究進展作綜述。

　　關鍵詞：低密度脂蛋白膽固醇；方法學；心血管疾病

　　臨床和流行病學研究證明血清中LDL-C與冠狀動脈粥樣硬化有密切的正相關[1]。在1986年病理學家們就研究證明LDL-C濃度越高時動脈粥樣硬化損傷的程度越大，粥樣硬化程度小時，測到血清中LDL-C也低[2,3]。

　　lDL是一組不均一的脂蛋白顆粒，一般認為LDL的漂浮密度為1.006～1.063，且包括了中間密度脂蛋白（LDL）1.006～1.019及Lp(a)1.050～1.080。LDL中蛋白含量約為20％～25％，主要是載脂蛋白B-100（ApoB-100），而載脂蛋白E（ApoE）和載脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）含量很少。膽固醇的含量約是血清中總量的三分之二。LDL是通過受體途徑進行降解，如過量時可以導致巨噬細胞和其他吞噬細胞變成泡沫細胞，這被認為是與動脈粥樣硬化有關的因素。因此，LDL-C的測定結果直接影響到分類和治療。美國的NCEP專家組以LDL-C濃度將成人、小孩、青少年各分為：成人在3.37mmol/L(1300mg/L)以下為合適水平，在3.37～4.12mmol/L(1300～1590mg/L)間作為中危水平，高於4.14mmol/L(1600mg/L)時作為高危水平；小孩和青少年在2.85mmol/L(1100mg/L)以下為合適水平，在2.85～3.34 mmol/L(1100～1290mg/L)為中危水平，高於3.37mmol/L(1300mg/L)為高危水平[4]。為提高LDL-C測檢水平，國內外對LDL-C測定方法進行廣泛的研究並不斷改善，現將有關方法研究進展綜述如下：

　　1 等密度和密度梯度超速離心法

　　血清中的各種脂蛋白的分離是LDL-C測定的一個重要環節。由於各種脂蛋白的大小、密度和組成及功能都有很大的不同。超速離心技術就是利用脂蛋白各種成分的密度不同將它們分離，是脂蛋白分離的主要方法。

　　1950年Delalla和Gofman首次報道等密度超速離心法。在實驗室中一般採用βQuantification（βQ）法，它利用1.006的臨界分離液，在離心力為10900g時離心18h，將血漿分成上下兩部分，上清液為VLDL和乳糜顆粒，下面為IDL、LDL和HDL。用試管切開技術將上下液體分開。下面部分再採用化學沉澱法將HDL和LDL及IDL分開，分別用酶法測定膽固醇。這方法已被臨床實驗室作為參考方法。而且還可以根據需要改變分離液密度，當密度提高為1.019，可以將IDL與LDL和HDL分開，也可提高到1.21，分離出HDL等。但在選擇脂蛋白分離切點系指它們與緩衝液混和物的密度，而不是脂蛋白自身的密度。

　　另外有報道用密度梯度超速離心法[5]。這種方法是將血清加入到已有不同密度梯度的分離液中，進行超速離心後，血清中脂蛋白的各種成份可以轉移到各自相等密度的相等的區域。這種方法可以一次將脂蛋白中的各種成份分離。而不足之處是要求離心時間很嚴格，分開各種組份較困難。根據離心轉子的不同，可以分為水平轉子，垂直轉子以及固定角度轉子。水平轉子在實驗中已被證明分離效果最好，但要求離心時間長（17～66h）；垂直轉子可以縮短時間（45min～3h），由於轉動距離小，會有微量丟失；在等密度超速離心中首選固定角度轉子，如在密度梯度超速離心中使用時，離心時間要比垂直轉子稍長。

　　這兩種方法對實驗室要求條件高，一般實驗室都難以應用。雖然現在有很多改良方法，克服了傳統方法的部分缺點，但分離的效果仍不能同傳統方法比。所有的超速離心法都有它們的局限性，它們所測得的結果仍是NCEP作為分類和治療的指標。

　　2譜法

　　根據脂蛋白分子的大小和親和性有很大的不同，利用層析技術對脂蛋白進行分離。目前有多種色譜儀和分離柱被用 於脂蛋白的分離。而瓊脂糖層析技術和Toya soda的高壓凝膠層析技術使用最普遍。這種方法是非破壞性，可以回收各種成份，有報道[6]LDL-C的回收率可以達到80％～98％，但穩定性較差。目前這種技術也在不斷完善，但要求實驗條件高，操作繁瑣，時間長，儀器昂貴，難以在臨床實驗室應用。

　　3電泳

　　電泳技術是基於脂蛋白分子所帶的電荷和分子量大小不同進行分離，早期這種技術在臨床實驗室普遍用於定性分析，直接觀察血清脂蛋白譜。現在已不再推廣使用，大量實驗證明電泳電量法所得的結果不能令人滿意，並且發現與常規實驗測得的結果有誤差。有報道[7]肝硬化膽道阻塞病人的血清脂蛋白譜顯示正常，而血清膽固醇濃度追憶忼於25.9mmol/L(10g/L)。因此還應進行總膽固醇（TC）測定。因為親脂性染料不能和遊離膽固醇以及磷脂結合。另外，可以與超速離心法和化學沉澱法聯合使用，經分離後，進行某一組份純度分析。免疫與電泳技術結合，可以大大提高準確度；以及全自動電泳分析儀出現，在常規實驗室進行脂蛋白定量分析將成為可能。

　　4　化學沉澱法

　　4.1　肝素沉澱法　肝素在pH值5.12檸檬酸緩衝液中可以沉澱LDL，使LDL與其它脂蛋白分離，然後進行膽固醇測定。這種方法pH值很重要。pH值必須使LDL顆粒的脂蛋白所帶電荷剛為正值。由於VLDL和LDL等電點分別為4.7和5.4，pH值5.12±0.02時LDL剛好可以完全沉澱，而VLDL不沉澱。肝素沉澱法與定量電泳法有很好的一致性，但當TG含量大於4.58mmol/L(4000mg/L)時，一致性相對降低。在Ⅲ型血漿脂蛋白增高症的病人血清中加沉澱劑時VLDL和Lp(a)與LDL發生共同沉澱，導致結果出現偏差。這種方法在TG低時，它有很好的精密度，變異係數小於3.5％。與等密度超速離心法比較，當TG濃度大於2.0mmol/L(1750mg/L)時，肝素法出現結果偏離[4]。近年Armstrong等[8]實驗證明降低pH值到4.85時Lp(a)沉澱。

　　4.2　聚乙烯硫酸（PVS）沉澱法　含有EDTA的PVS可將血清中LDL沉澱。PVS沉澱LDL是非離子相互作用，pH值影響較小，pH值在3～8範圍內均可以沉澱。因此，並不需要精確的pH值。沉澱劑中EDTA與血清中二價離子結合，阻止VLDL共同沉澱，而聚乙二醇獨甲醚（PEGME）加速LDL形成小球，可縮短沉澱時間。Assmann等[9]實驗證明PVS法可以將LDL同HDL、VLDL和LpX分離，但Lp(a)則完全同LDL共同沉澱，實際結果應包括Lp(a)所含的膽固醇。當血清中TG濃度小於4.2mmol/L（3680mg/L）時，與超速離心法有很好的一致性，但當TG大於4.6mmol/L(4070mg/L)時，PVS法所得結果偏低，且隨TG濃度的升高誤差也隨著增大。當血清TG低時，PVS法與其它所有方法都有很好的一致性，且有好的精確度，變異係數小於3.0％。

　　4.3 多環表面活化法 本法採用pH值6.10的異吡唑緩衝液中非特異兩歧性聚合物使LDL沉澱，然後將沉澱物重新溶解直接測定LDL-C或有TC與上清液膽固醇之差計算出。Moss等報道[10]此法與超速離心法和電泳法有很了的一致性，但與其他化學沉澱法一樣受血清中的TG濃度影響。

　　5　Friedewald公式計演算法

　　1972年Friedewald和Levy等首次提出用公式計算：LDL－C＝TC－(HDL－C＋VLDL－C），而VLDL－C＝TG×0.45(mmol/L)或VLDL－C＝TG×0.20(mg/L)。此公式是基於TG和比率恆定的情況與其它方法有很好的相關性，並要求空腹血清。如Ⅲ型血漿脂蛋白增高症的病人血清VLDL－C/TG變化很大，且TC、TG、HDL－C測定結果的準確性直接影響到LDL－C結果。如血活中TG升高時，LDL－C結果偏低，Ⅲ型血漿脂蛋白增高症病人的LVDL－C/TG的比率高達到0.947(mmol/L)[11,12]。因此此公式在臨床上的運用要求血清TG的濃度小於4.52mmol/L(4000mg/L)，否則會提供錯誤結果，會對分類和治療作出誤導。

　　6　免疫結合分離法

　　這種方法根據血清脂蛋白中 所含有載脂蛋白的種類和數量的差異，製備有關載脂蛋白的抗體，通過免疫結合，達到相應物質的沉澱，得到所需的結果。由於LDL含絕大部分ApoB-100，達到98％；而ApoA-I和apoE卻很微量。1993年Leary等[13]提出採用羊的多克隆抗Apo-A1和ApoE血清與乳膠顆粒結合，形成致敏劑，然後與脂蛋白的VLDL、HDL、IDL、乳糜顆粒等結合沉澱，分離出LDL並用酶法測定膽固醇。與βQ法作比較，空腹和非空腹血都有很好的一致性，相關係數分別為0.96和0.98，日內變異係數小於3％，日間變異係數小於4％，後來Castellani等[14]採用Sigma提供的試劑進行實驗，結果TG高於4.29mmol/L(3800mg/L)和HDL-C2.55mmol/L(990mg/L)時不影響LDL-C結果。而McNamara等[15]則認為上清液放在-80℃冰凍時間越長，結果變化越大，如放置26周後，結果改變達-13.66±5.35%。而Pisani等[16]採用200μl試劑加入30μl血清或血漿旋轉混勻，在室溫放置5～10min，離心分離上清液作LDL-C測定。且用本方法和βQ法分別對177份血清進行測定，兩方法的相關係數為0.980；分別對29份甘油三酯高於4.52mmol/L(4000mg/L)的血清進行測定。相關係數為0.927。本方法有很好精密度，日內和日間變異係數均小於3%。這種方法不要求用空腹血清，而且對高乳糜微粒血症、高TG血症和Ⅲ型血漿脂蛋白增高症病人血清一樣可以精確測定。這種方法被美國NCEP專家們推薦為常規實驗室測定的方法。

　由上可知，目前測定LDL-C的各種方法仍存在各自的優缺點，密度梯度超速離心法仍是目前認定的參考方法，國外也有把等密度超速離心法和化學沉澱法相互結合的βQ法作為金標準。化學沉澱法設備簡單。較易開展，但它們共同的一個特點，結果的準確度與TG的水平有關，而且分離不夠完全。Friedewald公式計演算法，要求空腹血清，且血清的TG、乳糜微粒濃度低時結果才能可靠。近年還有報道[17]此公式還受其它疾病的影響，化學沉澱法和Friedewald法得到LDL-CA結果，還包括Lp(a)-C的濃度，近年有報道[18]LDL-C和Lp(a)是反映血管疾病的兩個獨立因素，並提出應分別測定，讓LDL-C和Lp(a)各自更好提供冠心病以及動脈粥樣硬化的臨床意義。免疫結合分離法是上述各種方法中一種操作和設備都較簡便的方法，不受血清的來源和血清中TG、乳糜微粒以及其它疾病的干擾，結果可靠適合於一般實驗室使用，在國外已有試劑盒提供，國內由於試劑原因，還有待進一步實驗推廣。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！