m6A去甲基化酶通過維持FOXM1的表達來維持膠質瘤幹細胞的致瘤性
m6A是表觀調控基因表達，細胞表型的一種修飾方式。這種可逆的修飾方式在幹細胞分化、自我更新以及腫瘤形成過程中可能起著重要作用。下面這個研究在m6A研究方向上提供了一個很好的思路。這篇文章內容豐富充分、論證嚴密，從生物信息、臨床數據、體內體外模型到亞細胞器定位都有涉獵，值得一讀。
引言
mRNA修飾為細胞內的基因表達提供了一種額外的調控方式，這也是最近比較火熱的研究方向。N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA中最普遍的內部修飾，但其在人類疾病中的功能尚不清楚。本文作者研究發現，m6A去甲基化酶ALKBH5的過表達是膠質瘤幹細胞增殖和腫瘤發生所必需的，並且其與患者較差的預後相互關聯。此外，作者發現FOXM1是介導ALKBH5在膠質瘤幹細胞中ALKBH5的關鍵靶標。作者還發現了一個長鏈非編碼RNA能促進ALKBH5對FOXM1新生轉錄物的去甲基化。這也促進了FOXM1前體mRNA與HuR的相互作用，從而維持了FOXM1的表達。這些結果表明RNA m6A甲基化在腫瘤發展中具有關鍵作用，並為膠質母細胞瘤患者中靶向治療表觀轉錄組學調節劑提供了理論基礎。
作者首先從生物信息的方向出發，查詢了R2（http://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi），Freije，Phillips和REMBRANDT資料庫。在所有數據集中，ALKBH5表達升高預示患者預後差。然後，作者檢測了已建立的和代表不同階段惡性腫瘤的原髮膠質瘤細胞系中的ALKBH5表達。在正常人星形膠質細胞（NHAs），Hs683和SW1783細胞系（低級別膠質瘤）和U87MG和LN229 GBM細胞系中，ALKBH5弱表達或中等表達，但在U251MG GBM細胞和患者衍生的原發性GBM中高表達豐富具有自我更新和腫瘤增殖潛力的細胞，即GSCs。ALKBH5與自我更新的轉錄因子SOX2和GBM樣品中神經幹細胞標誌物的中間絲蛋白Nestin共表達。此外，使用TCGA GBM數據集的基因表達分析驗證了ALKBH5和SOX2或Nestin表達之間的正相關性。此外，比較GSC和其匹配的大量腫瘤之間的ALKBH5水平，表明GSC中ALKBH5表達顯著增加。
為了確定ALKBH5是否對GSC自我更新很重要，作者使用了兩種不同的短髮夾RNA（shRNA1和shRNA2;以下統稱為shALKBH5）來敲減ALKBH5的表達。通過有限稀釋法檢查，ALKBH5 shRNAs能顯著降低GSC11，GSC17和GSC23的腫瘤形成頻率。shALKBH5能降低Nestin以及SOX2，Nanog和Oct4（這是賦予腫瘤細胞自我更新能力的核心轉錄因子）的表達，證實了ALKBH5對GSC自我更新的影響。
Fig.1 ALKBH5維持膠質瘤幹細胞並是較差預後的指標
接下來，作者檢查了ALKBH5敲低對GSC增殖的影響。在GSC11，GSC17和GSC23細胞中，ALKBH5的丟失抑制了細胞生長（圖2A）和減少的DNA複製。 然而，ALKBH5的消耗對非CSC神經膠質瘤細胞SW1783的生長沒有影響。細胞周期分析顯示，敲除GSCs中的ALKBH5，增加了G0 / G1期細胞的比例，而降低了S和G2 / M期細胞的比例。
然後作者通過顱內注射，將shCtrl或shALKBH5轉導的10000個GSC11或GSC17細胞注射到小鼠中，研究ALKBH5敲減對GSC致瘤性的影響。與注射了shCtrl-GSC細胞的小鼠相比，那些注射shALKBH5-GSC細胞的小鼠顯示出延長的存活率，且具有較低的腫瘤形成率（圖2D）。 此外，通過過表達野生型ALKBH5（圖2E），可有效挽救shALKBH5對腦腫瘤形成的抑制。這些結果表明，ALKBH5的去甲基化活性對於GSC致瘤性是關鍵的。
Fig.2抑制ALKBH6後減少腫瘤增殖和成瘤
做到這裡，已經建立了ALKBH5和膠質瘤成瘤的關係，但ALKBH5作用哪個基因尚不清楚。所以，作者通過高通量篩選的方法鑒定出可能的作用基因。作者採用晶元分析來比較在GSC11和GSC17細胞中通過不同shRNA對ALKBH5敲低後的基因表達譜。選擇206個在兩種細胞系中差異表達至少2倍的基因用於智能通路分析（IPA）。作者發現，最大的基因子集主要涉及「細胞周期」，其次是「細胞組裝和組織」和「DNA複製，重組和修復」。
在由晶元鑒定的206個差異調節的轉錄物中，在RNA-seq數據集（m6A-seq輸入文庫）中發現了148個基因，其中85個基因在相同方向上重複顯示超過2倍的定量差異。接下來，篩選具有2倍表達改變的85個基因的5053個獨特的m6A峰，導致鑒定包括ABHD4，ANP32E，CENPF，FANCI，FOXM1，MKI67，BCL2，UBE2C，NT5E，IGFBP5在內的12個基因的13個峰。在這些結果中，只有FOXM1是12個候選基因之一。 FOXM1是細胞周期調控中的關鍵轉錄因子，在GSCs的自我更新和腫瘤發生過程中發揮重要作用。
Fig.3 ALKBH5缺陷細胞中m6A修飾和基因表達情況
由於FOXM1可能是ALKBH5的直接底物，也是改變增殖基因譜的驅動因子，作者直接研究ALKBH5對FOXM1表達的調控機制。作者首先測量了ALKBH5敲低後總mRNA表達和FOXM1不同亞型（FOXM1A，-B和-C）水平的變化。與基因表達數據一致，具有ALKBH5敲低的GSC11和GSC17顯示FOXM1 mRNA的總體和同種型的約70％-80％的較低表達。作者還通過小干擾RNA（siRNA）處理或shRNA慢病毒轉導測量了ALKBH5敲低後FOXM1和SOX2的蛋白表達。短暫的和穩定的敲減都降低了FOXM1蛋白的丰度。接下來，作者檢查了GBM患者樣品中ALKBH5和FOXM1之間的相關性。作者研究了TCGA數據集，發現ALKBH5和FOXM1 mRNA表達之間有顯著的正相關性。通過對原代GBM樣品中ALKBH5和FOXM1蛋白的表達和相關性的免疫熒光分析證實了該結果。
為了確定FOXM1新生轉錄物是否是ALKBH5的底物，作者使用甲基化的RNA免疫沉澱（MeRIP）與qPCR結合來確定ALKBH5敲低後的FOXM1m6A甲基化水平。證實看m6A甲基化易於在FOXM1前mRNA上檢測到。 此外，與對照相比，ALKBH5敲低增加了FOXM1前mRNA的m6A水平。 野生型ALKBH5的過表達能夠恢復FOXM1表達，表明ALKBH5通過其去甲基化活性主要影響FOXM1表達。
Fig.4 ALKBH5維持FOXM1的表達
由於之前的研究表明FOXM1中的m6A峰主要在在終止密碼子附近有一個峰和在3"UTR有一個獨特的峰。這個獨特的峰被ALKBH5特異性去甲基化，表明了功能上的相關性。為了進一步研究FOXM1 3"UTR區域的重要性，作者使用3"UTR（CDS-3"UTR）或單獨的CDS產生含有完整FOXM1（包括編碼序列（CDS））的FLAG標記的表達構建體。在ALKBH5敲低後，在用FOXM1CDS-3"UTR構建體轉染的GSCs中FLAG-FOXM1表達顯著降低，但不是FOXM1CDS-單獨構建體，這表明3"UTR參與ALKBH5 -FOXM1。FOXM1 3"UTR的作用可以由兩種不同的模型中的一種解釋：（1）串聯順式調節模型，其中3"UTR作為感測器，而FOXM1CDS m6A位點是效應物，或（2），其中3"UTR足以啟動調控，而不管編碼序列中的m6A狀態如何。為了測試這些可能性，作者進行了FOXM1 3"UTR-報告熒光素酶測定，發現ALKBH5敲低降低了含有FOXM13"UTR的螢光素酶構建體的活性，傾向於第二種模型。
為了檢驗HuR在這個系統中的作用，作者首先測試HuR是否與FOXM1新生轉錄物相互作用。RIP-qPCR顯示HuR與FOXM1前mRNA相互作用，並且這種相互作用在ALKBH5敲低後降低。 此外，瞬時HuR敲減抑制FOXM1表達。 這些數據表明HuR在通過結合未甲基化的3"UTR來促進FOXM1新生轉錄物的表達中在ALKBH5調節FOXM1中起重要作用。
Fig.5 FOXM1 3UTR介導ALKBH5調節
作者隨後調查了可能有助於ALKBH5優先調控FOXM1 3"UTR的局部元件。12號染色體（chr12：2945982-2968961，GRCh37 / hg19）的長非編碼RNA（lncRNA）LOC100507424;這個lncRNA的轉錄方向與FOXM1相反，與FOXM1 mRNA的最後一個外顯子有457個核苷酸互補。作者研究LOC100507424（以下簡稱為FOXM1-AS）有幾個原因。首先，基於它們的序列互補性，FOXM1-AS可以調節FOXM1在順式中的表達。其次，如通過使用FOXM1-AS非重疊區域的引物的qPCR所確定的，具有高水平FOXM1-AS的大多數GSC細胞也以高水平表達FOXM1，這暗示了調節的一致模式。第三，FOXM1-AS富含不溶性部分，表明FOXM1-AS位於與ALKBH5和FOXM1新生轉錄物相同的細胞部分。
接下來，作者探討FOXM1-AS是否與FOXM1轉錄本相互作用。結果表明，FOXM1新生轉錄物，但不是成熟的mRNA在體內與FOXM1-AS相關。在發現FOXM1-AS與FOXM1新生轉錄物和ALKBH5蛋白相互作用並且知道ALKBH5與FOXM1 RNA結合後，作者研究了前者是否需要後者。敲低FOXM1-AS能導致ALKBH5相關的FOXM1新生轉錄物減少，表明FOXM1-AS的正調節作用。FOXM1-AS敲減增加了FOXM1前mRNA的m6A修飾。 此外，FOXM1-AS敲減以類似於ALKBH5敲低的方式，降低的FOXM1 3"UTR螢光素酶活性和降低的HuR和FOXM1RNA結合，降低FLAG-FOXM1表達。
Fig.6 FOXM1-AS提供ALKBH5和FOXM1互作
接下來，作者試圖確定FOXM1-AS在GSC中是否具有生物學功能。 敲低FOXM1-AS導致FOXM1 RNA和蛋白質的表達顯著降低。此外，shFOXM1-AS顯著降低GSC生長和DNA複製。 此外，shFOXM1-AS損傷腫瘤球形成並抑制GSC標記物表達，其通過強制性重新表達FOXM1-AS而獲得拯救。因此，我們得出這樣的結論：FOXM1-AS刺激FOXM1表達，並有助於GSC維持。
Fig.7 敲減FOXM1-AS抑制了FOXM1的表達和腫瘤幹細胞成球
為了確定FOXM1是否是GSC增殖中ALKBH5功能的主要貢獻者，作者發現加回FOXM1能夠逆轉ALKBH5抑制的作用。此外，注射GSC11和GSC17對照細胞的小鼠產生類似於人GBM的腦腫瘤，而ALKBH5或FOXM1-AS的消耗實質上抑制腦腫瘤形成。我們證實，對照異種移植物在腫瘤損傷中共表達ALKBH5和FOXM1，除了減少FOXM1外，ALKBH5或FOXM1-AS的消耗減少了SOX2和增殖標誌物Ki67的表達。 此外，FOXM1 CDS的異位表達大大消除了腫瘤生長抑制，併產生了高表達SOX2和Ki67的腦腫瘤。 這些結果提示ALKBH5和FOXM1-AS協同調控FOXM1並在GSC腫瘤發生中起重要作用。
Fig.8 FOXM1能恢復敲減ALKBH5和FOXM1-AS後腫瘤生長能力
原文:Zhang S, et al. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program.Cancer Cell.2017 Apr 10;31(4):591-606.e6.
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