酵母雙雜技術探索骨骼發育的過程，原來是這樣的……

骨骼是脊椎動物內的堅硬器官，具有保護、支持、造血、儲存和運動的功能，骨骼的發育至關人體的身心健康。骨骼的發育是極其複雜的一個過程，具有眾多調控因子參與其中。目前，已有大量研究表明，有一種轉錄因子—Runx2，就參與到骨骼的發育過程中，它在肥大軟骨細胞中表達活躍，並在軟骨細胞發育為成骨的過程中發揮著至關重要的作用。Runx2基因沉默的小鼠體內明顯缺乏礦物豐富的組織，並且骨骼的生長發育明顯受到阻礙。在人體中，Runx2的表達異常，會致顱骨鎖骨發育不良。為了探尋和Runx2共同發揮作用的互作蛋白，有篇文章採用酵母雙雜交的技術來尋求答案，並最終獲得與Runx2互作的蛋白。

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作者首先在NCBI上找到小鼠Runx2基因的序列信息。它共計9個外顯子，編碼區在第2到第9個外顯子上，隨後作者把ORF區域構建到pGBKT7載體上。

A：Runx2基因外顯子信息；B：pGBKT7-Runx2載體的構建

為了證實構建的pGBKT7-Runx2載體可以正常表達，並且不會對酵母的生長產生毒性影響，作者將其轉化進酵母，在SD/-Trp的平板上進行塗板驗證。發現酵母生長正常，即表示載體構建成功。

隨後作者對庫質粒cDNA進行LD-PCR檢測（所用引物為特殊的隨機引物—CDSIII/6），共計兩種cDNA，來源於肥大區域軟骨細胞及MCT細胞的總RNA反轉錄。結果顯示，大部分PCR產物在500bp附近。然後將這些文庫質粒同pGBKT7-Runx2載體進行共轉，篩選出在SD/-Leu-His-Trp-Ade/ABA/X-ɑgal平板上生長的陽性克隆。

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A：LD-PCR結果；B：Prey載體與Bait載體進行共轉；C：篩選得到的陽性克隆

抽提陽性克隆的質粒，通過ADLD-PCR檢測插入片段的大小，並將PCR產物純化，然後進行測序，獲得其序列信息。通過對比NCBI/GenBank資料庫的信息，作者篩選出幾個潛在的轉錄因子，包括Col1a2, Edf1(Endothelial differentiation factor), Lgals1 (Lectin, galactose binding, soluble 1-1), and Timp-2。隨後作者在GenePaint上尋求這些基因的表達情況，並和肥大軟骨細胞特異表達基因—Col10a1進行對比，發現這些基因表達均不相同，Col10a1作為陽性對照表達最強，Lgals1表達較強，Col10a2表達較弱，而Edf1表達最弱。

GenePaint資料庫上顯示的不同候選基因表達情況

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最後，作者通過RNA半定量和定量（qRT-PCR）的實驗檢測在增殖的MCT細胞和肥大的MCT細胞中這些候選基因的表達情況，發現陽性對照Col10a1在兩種類型的MCT細胞中表達差異最大，Timp-2和Lgals1也存在明顯的表達差異，但Timp-2的差異更為明顯。

A：候選基因表達半定量結果；B：候選基因表達定量結果（32℃：MCT細胞處於增殖狀態；37℃：MCT細胞處於肥大狀態）

作者通過酵母雙雜交的技術篩選到與Runx2互作的蛋白Timp-2，並且其表達情況與陽性對照Col10a1的表達情況最為類似，故作者得出結論，Timp-2蛋白可能與Runx2一起參與到骨骼發育過程中，為骨骼發育的機製做出了進一步的闡釋。

參考文獻：YFeifei Li, Rui Mi, Chuling Fan, Ping Zhang ,et al. Runx2-interacting genes identified by yeast two-hybrid screening of libraries generated from hypertrophic chondrocytes. Am J Transl Res 2016;8(12):5465-5474

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