膜聯氨基酸脫氨酶工程菌催化酪氨酸合成對羥基苯丙酮酸的研究

Biosynthesis of 4-hydroxyphenylpyruvic acid from L-tyrosine using recombinant Escherichia coli cells expressing membrane bound L-amino acid deaminase

呂常江，黃俊，胡升，姚善涇，

梅樂和，王進波，梅家祺

(浙江大學寧波理工學院)

內容簡介

對羥基苯丙酮酸（4-Hydroxyphenylpyruvic acid, 4-HPPA）是生物體內L-酪氨酸代謝產生的α-酮酸。由於4-HPPA的特殊結構和性質，其在食品、製藥、化工產業中有著重要的應用價值。以L-氨基酸為原料進行α-酮酸的製備具有經濟和高效的特點。在可以將L-氨基酸轉化為α-酮酸的酶中，膜聯L-氨基酸脫氨酶（membrane bound L-amino acid deaminase, mL-AAD）因其具有不需要額外添加輔酶因子以及在催化反應中不產生H2O2（對產物具有降解作用）的特點，成為了α-酮酸及其衍生物製備的理想用酶。本研究建立了一種利用過表達普通變形桿菌（Proteus vulgaris）mL-AAD工程菌轉化L-酪氨酸進行4-HPPA製備的方法。具體研究內容如下：（1）由於mL-AAD是鑲嵌於細胞內膜外側的膜蛋白，其能否高效準確地定位是製備菌體催化劑的關鍵。為此，本研究首先採用pET28a和pET20b兩個表達載體分別構建了以mL-AAD自帶的TAT信號肽(雙精氨酸轉移途徑)和pelB (保守分泌途徑)-TAT整合信號肽介導的mL-AAD分泌表達系統，並考察了這兩種表達方式對mL-AAD分泌表達效率的影響。結果表明，發現由ml-AAD自身TAT信號肽介導的分泌表達策略（表達出天然形式的ml-AAD）可以獲得更高的菌體催化活力和生物量，更適合菌體催化劑的製備。（2）對mL-AAD工程菌BL21(DE3)-pET-28a-mlaad催化L-酪氨酸的反應條件進行優化。發現BL21(DE3)-pET-28a-mlaad可以在pH 9.0值，溫度37℃和菌體濃度為0.74 mg/mL的條件下獲得最優催化反應速率。（3）以L-酪氨酸為底物，利用BL21(DE3)-pET-28a-mlaad工程菌進行4-HPPA的製備。由於先前文獻報道，4-HPPA在鹼性條件下，尤其是當溶液pH在10-12的範圍內極易發生降解。因此，本研究首先考察了在上述優化反應條件下4-HPPA的降解情況，發現雖然4-HPPA在優化的反應條件下隨著時間的延長而不斷降解，但12 h後溶液中的4-HPPA含量仍能保持在92%以上，說明在優化的條件下4-HPPA降解並不嚴重，因此用優化的條件製備4-HPPA是可行的。在優化條件下，採用不同底物含量的L-酪氨酸(100-300 mM) 進行4-HPPA的製備。在底物濃度為100 mM的情況下，反應液在10 h就變得澄清，意味著底物消耗完畢，此時溶液中的4-HPPA含量為72.72±3.81，產率為72.7%。在底物含量為200和300 mM的情況下，溶液中始終懸浮有未消耗的L-酪氨酸，說明在這兩種底物濃度下，菌體細胞不能將底物進行完全轉化。當底物含量為200和300 mM時，反應液中4-HPPA的最高值都出現在12 h，此時4-HPPA的含量分別為95.75±3.11和84.71±1.63 mM。雖然底物含量為200 mM時，底物的轉化率要低於100 mM時的，但由於L-酪氨酸的價格相對低廉，因此採用200 mM的底物含量進行4-HPPA的製備也是經濟可行的。本研究建立的4-HPPA製備方法可以避免傳統化學合成法步驟多、使用刺激性原料以及環境污染嚴重等不利之處，同時具有反應效率高以及原料價格便宜、來源廣且可生物製備的特點。因此本研究建立的4-HPPA方法具有良好工業應用前景。同時，本研究也為芳香族α-酮酸和酚酸類天然產物的生物製備奠定了研究基礎。

圖表導讀

通訊作者及團隊介紹

梅樂和，教授，博士生導師，寧波市「甬江學者計劃」特聘教授，浙江省跨世紀 「151人才工程」第一層次培養人員。現任浙江大學寧波理工學院副院長，兼任中國生物工程學會理事、浙江省生物工程學會副理事長、浙江省化工學會常務理事、寧波市醫療器械行業學會名譽會長。主要從事生物工程、生物製藥、化學工程等領域的教學與科研工作，涉及生物分子工程，酶工程，生物催化與轉化，微生物工程，發酵工程等研究方向。作為負責人承擔過國家自然科學基金青年項目和面上項目7項和973、863子課題多項，參加過國家自然科學基金重點項目2項，主持承擔浙江省自然科學基金重點項目1項、浙江省科技重大專項等省部級科研項目多項4項、寧波市重大科技專項1項、橫向課題若干項。發表論文200餘篇篇，其中有100餘篇被SCI/EI收錄，獲得授權發明專利20餘項。編寫國家級「十一五」、「十二五」規劃教材及浙江省省重點教材4本，其中主編的一本教材獲2007年國家級精品教材。曾獲國家教育部科技進步一等獎、浙江省科學技術獎（自然科學）二等獎、浙江省高等學校科研成果獎二等獎、寧波市科學技術獎二等獎、寧波市科技創新推動獎、浙江大學優秀教學成果一等獎、二等獎等。

梅樂和教授團隊長期致力於蛋白質分子定向進化技術以及面向高附加值生理活性物質的生物製造技術研究，團隊成員包括微生物學、分子生物學、生物化學、生物信息學、結構生物學等多方面的專業技術人員，由年富力強具有博士學位的中青年科技工作者組成。在酶的定向進化研究領域處於國內領先水平，構建了一系列催化性能得到顯著改善的細胞色素P450 BM-3和短乳桿菌谷氨酸脫羧酶的突變酶，在國際上首先獲得了短乳桿菌谷氨酸脫羧酶的蛋白質晶體結構，在靛藍和γ-氨基丁酸等物質的生物製備技術上取得了突出性的成果，在細胞色素P450 BM-3酶定向進化研究和短乳桿菌谷氨酸脫羧酶研究領域具有一定的國際知名度

研究團隊照片

（後排左起第5人為通訊作者梅樂和教授）

全文鏈接(doi號):

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S100495411730589X

聲明

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