眼表常見警報素的研究進展

本文作者：李煒煒，馬林，苑曉勇

作者單位：300020　天津市，天津市眼科醫院 天津市眼科學與視覺科學重點實驗室 天津醫科大學眼科臨床學院

摘要

警報素是機體內固有的內源性分子，是免疫系統的早期預警信號。研究表明，眼表炎症時多種警報素的表達異常，如高遷移率族蛋白B1、多種抗菌肽、白細胞介素33、S100蛋白等，並在疾病的病理生理過程中起到多種作用，如促炎、抗炎、抗菌、促進傷口癒合等作用。本文就上述警報素在眼表相關疾病中的研究進展作一綜述。對警報素的研究有利於深入了解相關疾病的發病機制和尋找新的治療方法。

警報素（alarmins）是一類機體內固有的內源性分子，其重要作用是作為免疫系統的早期預警信號［1］。早期的研究認為［2］，機體免疫系統對感染性異物的免疫反應主要通過抗原提呈細胞（antigen-presenting cells，APC）表面的模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）識別病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。PRRs與相應的PAMPs作用，激活APC，上調刺激信號，進而引起T細胞的活化。但這個理論不能完全解釋在非感染性異物入侵時產生的免疫反應，如免疫排斥反應和自身免疫性疾病等。因此，又有學者提出［3］，一些危險信號如細胞死亡、組織損傷以及微生物入侵等可引起免疫系統的反應，這個理論被稱為損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）。隨後，在感染性休克患者血液中發現了一種重要的DAMP——高遷移率族蛋白B1（high-mobility group box B protein 1，HMGB1），此後對DAMP的認識有了重大進展［4］。

通過大量的對HMGB1和一些抗菌肽（antimicrobial peptides，AMP）的研究，發現這些內源性的多功能介質具有一些共同的特徵：存在於細胞核或細胞漿中，並在細胞脫顆粒、死亡或是被誘導之後迅速釋放［1］。當其被釋放到細胞外後，可通過細胞受體傳遞信號，從而引起免疫細胞的募集和激活，最終加強固有免疫和適應性免疫反應［5］。因此，這些固有的內源性分子作為免疫系統早期的預警信號被稱為警報素。目前認為，警報素是有助於保護宿主防禦系統的具有免疫刺激功能的DAMP［6］。

除感染外，目前有較多關於警報素與各種疾病的研究，如腫瘤［6］、糖尿病［7］、自身免疫性疾病［8］等。在眼表，包括HMGB1、多種抗菌肽、S100蛋白等多種警報素的研究已見報道。本文就眼表常見警報素的相關研究進展作一綜述。

1

HMGB1

HMGB1是一種廣泛存在於哺乳動物細胞核內的高度保守的DNA 結合蛋白［9］。也是發現較早的警報素之一。在細胞核內時具有穩定染色體和調節基因轉錄的作用［10］。由於HMGB1缺少前導序列，因此它可通過被稱為「非經典分泌途徑」的膜泡運輸轉運至細胞外間隙［11］。也可在細胞壞死或凋亡的晚期細胞膜通透性下降的情況下被動釋放至細胞外間隙［12-13］。在細胞外間隙中，HMGB1可與多種受體結合，包括Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）-2、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9以及晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE），成為警報素傳遞信號［6］。

在結構上，HMGB1具有兩個與DNA結合的亞單位（A box 和B box）。A box具有抗炎的作用，而B box通過誘導釋放多種細胞因子具有促炎活性的作用［14］。目前報道的多種疾病均與其有關，包括敗血症［15］、缺血-再灌注損傷［16］、腫瘤［6］、自身免疫性疾病［8］等。HMGB1在眼科的研究報道較少，在視網膜脫離的動物模型中，發現玻璃體中的HMGB1表達明顯上調［17］，在增生型糖尿病視網膜病變中，HMGB1和AGE的表達增加［18］。近年來，在眼表，有學者通過建立小鼠鹼燒傷模型證實了局部釋放的HMGB1通過TLR4受體引起巨噬細胞的浸潤，進而引起促血管生成因子的釋放，導致新生血管的形成［19］。在感染性炎症方面，Mcclellan等［20］發現沉默HMGB1基因可使小鼠銅綠假單胞菌性角膜炎模型的病情減輕，通過減少白細胞浸潤降低促炎症因子的水平，同時也減少巨噬細胞和單核細胞的浸潤。還有學者發現，HMGB1還參與由紫外線引起的慢性結膜炎症的發病機制，如翼狀胬肉［14］。這些研究為眼表一些感染性及非感染性疾病的治療提供了新靶點。

2

AMP

AMP是廣泛存在於植物和動物中的陽離子多肽，由50個以下氨基酸組成［21］。AMP對細菌、真菌、酵母菌和包膜病毒具有抵抗作用。哺乳動物主要存在於各種上皮細胞和中性粒細胞中，主要參與機體的固有免疫。也可通過參與細胞信號或作為非成熟樹突狀細胞和T細胞的趨化因子而成為固有免疫和適應性免疫之間的橋樑［22］。目前研究較多的AMP主要包括防禦素、LL-37和嗜酸粒細胞衍生神經毒素等［6］。

2.1　防禦素　防禦素（defensins）相對分子質量為2000~6000，被稱為低相對分子質量抗菌肽，富含二硫鍵，主要對革蘭陽性和陰性細菌、真菌及某些包膜病毒有抵抗作用［23］。根據二硫鍵的不同連接方式和氨基酸的數量可分為α、β和θ亞型。α防禦素主要在人類、猴和一些嚙齒類動物的中性粒細胞和小腸的潘氏細胞中表達，β防禦素主要在哺乳動物表皮和支氣管上皮細胞中表達，人類中僅發現了α防禦素和β防禦素。θ防禦素僅存在於靈長類動物的巨噬細胞中［24］。

2.1.1　α防禦素　人類的α防禦素主要分為兩個亞型：人中性粒細胞肽（human neutrophil peptide，HNP）和人防禦素（human defensin，HD）［24］。目前發現的人類α防禦素主要包括HNP1~4以及HD5和HD6［23］。中性粒細胞是HNP的主要來源，早在上世紀九十年代，有研究在發生排斥反應的角膜植片基質和感染後期的角膜組織中發現了HNP1~3，隨後在炎症的結膜組織和正常淚液中也發現了HNP1~3［21］。HD5和HD6主要存在於小腸的潘氏細胞中，在眼表組織中未檢測到［21］。

2.1.2　β防禦素　人β防禦素（human β-defensins，hBD）是在眼表最先發現［25］且研究較多的一類防禦素。角結膜上皮細胞均可表達hBD。其中，hBD-1在正常的角結膜上皮為固有表達，hBD-2為誘導性表達［25］，但也有研究發現hBD-2在正常角膜組織及體外培養的角膜上皮細胞中都有表達［26］。近年來的研究表明，hBD-3在正常角膜和結膜上皮固有表達［27］，在體外培養的角膜上皮中也發現了hBD-4的表達［28］。另外，hBD-9是近年新發現的hBD，在正常的角膜和結膜上皮細胞中表達，並通過TLR和核苷酸結合寡聚域（nucleotide oligomerization domain，NOD）樣受體調節hBD-9的水平［29］。

目前，β防禦素在眼表的研究主要集中在感染（包括細菌、真菌和阿米巴性角膜炎）和乾眼方面。β防禦素對於大部分細菌均有良好的抗菌活性，包括耐葯細菌如銅綠假單胞菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌［22］。Wu等［30］發現在銅綠假單胞菌性角膜炎小鼠模型中，鼠β防禦素3和4（與hBD-2和hBD-3同源）在細菌負荷、白細胞浸潤和對促炎因子如γ干擾素、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、腫瘤壞死因子α等方面具有調節作用，並能誘導TLR-2、TLR-4和核轉錄因子-κB的表達，從而加強了角膜對感染的抵抗能力。同樣，有研究也證實了敲除β防禦素3基因的小鼠角膜上皮細胞對銅綠假單胞菌的易感性增強［31］。在一些條件致病菌如假白喉棒狀桿菌引起的角膜感染中，hBD-1表達明顯增強［32］。體外實驗發現，人角膜上皮細胞與熱滅活的白色念珠菌共培養後，hBD-2和hBD-3表達呈劑量依賴性增加，相應蛋白水平與正常對照組相比也明顯升高［28］。而對於阿米巴原蟲的體外實驗發現，角膜上皮細胞與阿米巴原蟲共培養後，hBD-2和hBD-3 的表達均出現了明顯的增加，而hBD-1明顯下調，hBD-9出現了表達先增高後下降的趨勢［33］。也有研究發現與正常的角結膜上皮相比，在眼表感染和炎症的情況下hBD-9的表達出現明顯減少［22，27］。防禦素在感染性角膜病的研究為其治療提供了新思路。在乾眼的研究中，無論是通過對體外培養的角膜上皮細胞構建的乾眼模型［34］，還是通過印跡細胞學對乾眼患者結膜上皮中hBD-2 mRNA的檢測［35］，均發現了其表達的增加，且hBD-2 mRNA增加的程度與角膜熒光素染色情況明顯相關。提示在眼表狀態異常時防禦素對眼表有保護作用，但同時被激活的TLR可能對眼表有損傷作用。

2.2　LL-37　抗菌肽LL-37因含有37個氨基酸殘基，且N端前兩個氨基酸殘基為亮氨酸（L）而得名，是人體內唯一的Cathelicidin家族抗菌肽［21］。LL-37是宿主防禦系統的重要組成部分，對多數革蘭陰性菌和陽性菌均有良好的抑制作用［36］。在眼表，角結膜上皮均可表達LL-37［21］。除早期發現的對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌具有高效的抗微生物活性外，近年體外實驗證實在與阿米巴原蟲［33］以及真菌［28］共培養的角膜上皮細胞中LL-37表達增加。另外，LL-37也具有促進角膜組織損傷修復的作用，並可引起多種炎症細胞和免疫細胞如單核細胞、T細胞、肥大細胞等的浸潤，也可誘導樹突狀細胞分化，促使其分泌細胞因子，從而促進炎症反應的發生［37］。

2.3　嗜酸粒細胞衍生神經毒素　嗜酸粒細胞衍生神經毒素（eosinophil-derived neurotoxin）存在於嗜酸性粒細胞的顆粒中，是核糖核酸酶家族成員［6］，對成熟和非成熟的樹突狀細胞均有趨化作用，這提示嗜酸粒細胞衍生神經毒素對樹突狀細胞的運輸有調節作用［38］。目前在眼表主要將其作為過敏性疾病中的炎症介質來研究［39］。

3

IL-33

IL-33是IL-1家族成員，其不僅是促炎因子也是核轉錄因子［5］，作為Th2細胞有效的誘導物，可誘導Th2相關細胞因子從極化的Th2細胞、肥大細胞和嗜鹼性粒細胞中釋放［40］。IL-33可在多種細胞中表達，如上皮細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞等［41］。IL-33是ST2的特異性配體。早期研究發現，IL-33/ST2信號通過活化肥大細胞在慢性過敏性結膜炎的病理過程中起一定的作用［42］。目前在眼表主要集中於感染性炎症的研究。Hazlett等［43］發現，IL-33在小鼠的角膜上皮細胞中固有表達，並且在小鼠角膜感染銅綠假單胞菌後表達增加，蛋白水平也相應增高。IL-33可通過促進Th2型的免疫反應，並使角膜中巨噬細胞極化後產生抗炎介質來減輕角膜的感染。同樣有研究發現，角膜上皮細胞中的IL-33可被多種病毒或細菌成分（主要是polyI：C和鞭毛蛋白）誘導出現mRNA和蛋白水平的增加［44］。此後，有研究通過IL-33與體外培養的角膜上皮細胞作用後，發現ST2蛋白水平明顯升高，並揭示了IL-33/ST2信號可通過核轉錄因子-κB通路促進角膜上皮細胞分泌炎症因子和趨化因子［40］。

4

S100蛋白

S100蛋白家族廣泛存在於脊椎動物體內，包括20多個存在於細胞質內的小相對分子質量鈣結合蛋白［6］，因其能溶解於1000 g·L-1硫酸銨溶液而得名［45］，主要在中性粒細胞、巨噬細胞和上皮源性的細胞表達［6］。S100蛋白家族通過對鈣離子的調節和對靶蛋白的作用，參與細胞的增殖、分化等過程［46］。其中S100A8和A9可形成異二聚體的形式作為警報素參與多種炎症和自身免疫反應過程［6］。由於二者主要來源於具有吞噬功能的髓系細胞，因此又稱為髓相關蛋白8和14（myeloid-related protein 8 and 14，MRP8/14）［47］。Deng等［47］通過對銅綠假單胞菌性角膜炎的研究顯示，在患者的角膜刮片和小鼠動物模型中，MRP8/14mRNA表達明顯增加，主要存在於角膜基質浸潤的炎症細胞內和細胞外，並且隨病程和病變的嚴重程度呈動態變化。沉默小鼠MRP8/14基因後可明顯減輕病變的嚴重程度、減少細菌的清除，並且抑制了白細胞的浸潤和促炎症因子的產生。從而提示MRP8/14在細菌性角膜炎中有雙向作用，即促進細菌清除的同時，也可通過加強促炎症因子的表達而放大眼表的炎症反應。除此之外，在非感染性炎症方面，有研究在正常結膜表層上皮和翼狀胬肉組織中均發現了S100A8和A9的存在，並且翼狀胬肉組織中的水平明顯增加，推測S100A8和A9 參與了細胞骨架的重組［45］。

除上述的警報素外，尿酸、ATP等核苷酸及其代謝產物，某些細胞外基質降解產物等也可作為警報素誘導固有免疫和適應性免疫［6］，但其在眼表的研究尚未見報道。

綜上所述，在眼表，目前警報素的研究多見於某些感染性角膜病以及非感染性疾病如乾眼、翼狀胬肉等，警報素參與這些疾病的病理生理過程，並通過不同的信號系統調節固有免疫和適應性免疫，從而起到多種作用，如抗炎或促炎、抗菌、促進傷口修復等作用。警報素作為機體內自身存在的物質，與目前臨床中成品抗炎或抗菌藥物相比具有毒副作用小、不易產生耐葯等優點，因此，警報素的研究不僅為闡明這些疾病的發病機制提供了新的思路，也為臨床治療提供了新方法。

參考文獻略

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