全長轉錄組和你分享一個跨越了770萬年的別離

「一別經年久，世事兩茫茫」，自數百萬年前分離後，玉米與摩擦禾從此分道揚鑣，形同陌路。這究竟是一個凄慘的別離，還是為了更好的相聚！接下來讓我們利用全長轉錄組方法，給您還原一個770萬年前的愛恨情仇。

玉米及其野生近緣物種是植物遺傳學的主要模型，對於其野生近緣植物的生物多樣性研究是作物育種工作的主要方法。玉米的直系祖先maize或者Z. m. parviglumis，及其屬內的其他物種和亞種，主要分布在墨西哥、瓜地馬拉、尼加拉瓜和宏都拉斯等熱帶和亞熱帶地區。如墨西哥類蜀黍與玉米同屬內親緣關係最近。

在玉米屬外，摩擦草屬與玉米親緣關係最近。但是摩擦草屬的氣候適應性要比野生的墨西哥類蜀黍要強，更適應於北美洲和南美洲的溫帶地區氣候，研究人員推測玉米和摩擦草屬的共同祖先已經適應了熱帶緯度，因此通過自然選擇篩選溫帶氣候的適應性是研究人工選育溫帶氣候玉米的潛在方法。

樣本準備與文庫構建

野生摩擦草屬的摩擦禾種子發芽生長的單一植株 (根，葉和莖) 提取 RNA樣本。分別構建1-2kb、2-3kb和3-6kb文庫，2cell/文庫，PacBio RS II平台。

下機數據處理

將下機數據使用SMRT v2.3.0分析原始讀取數據，分析步驟如下：

1. minimum full-passes=0，predicted consensus accuracy =75%，滿足指標的認為是ROIs(CCS)。

2. 檢測5"，3"primer和polyA確定是否為全長；去除序列之間有adapter，得到全長非嵌合 (FLNC)。

3. 利用ICE方法將非全長轉錄本校正全長轉錄本，校正後準確率> 99％。

4. 使用GMAP將HQ polished consensus比對到玉米參考基因組(B73 RefGen v3)，並使用pbtranscript-ToFU包的sam.py腳本，參數為min-coverage = 85% 和 min-identity =82% 去冗餘；若轉錄本僅在第一個外顯子的5"端有差異，會被歸類為冗餘和降解。

使用GMAP，發現約有98.04％ (64,362個HQ中的63,103個) 的摩擦禾全長轉錄組可比對到玉米參考基因組 (RefGen v3)，說明二者的基因結構具有較高的相似度。

圖1 摩擦禾全長轉錄組比對玉米參考基因 (RefGen v3) circos圖

可變剪切分析

與其他植物系統的觀察結果相一致，摩擦禾中最常見的可變剪切分別是內含子滯留(IntronR)、外顯子跳躍 (ExonS)、5"端可變剪切 (AltD)、3"端可變剪切 (AltA) 和外顯子互斥 (MXEs)，剩餘的類型包含兩種或更多類型被歸類為複合型可變剪切 (CompAS)。利用全長轉錄組測序技術發現，玉米轉錄組中包含更多的可變剪切事件，而且在玉米和摩擦禾的直系同源基因中發現有超過2/3的保守基因發生可變剪切，而在摩擦禾中有409個基因是玉蜀黍屬-摩擦草屬特有的。

圖2 摩擦禾、玉米以及摩擦禾與玉米間保守的選擇性剪切 (AS) 類型

IncRNA分析

圖3 玉米(紅)與摩擦草(藍)的PacBio lncRNA長度比較

構建進化樹

1. 使用ParaAT2.0獲得直系同源基因數據集；

2. PAML中CodeML最大似然法(runmode =-2，CodonFreq = 2)和已知的系統發育關係計算同義核苷酸替換率 (Ks)；

3. 根據公式T = Ks / 2μ估算玉米和摩擦禾之間的分化時間 (T)；

4. 使用Codeml程序 (runmode = 0) 計算分支特定的Ka / Ks比率以及夠建系統發育樹。

選取摩擦草屬和玉蜀黎屬為目標物種，高粱屬、狗尾草屬、復活草屬為背景物種，稻屬、短柄草屬為外參物種，構建系統進化樹。發現摩擦草屬和玉蜀黎屬中的6,950個直向同源基因在七種草類物種均有發現，包括4,162個一對一，1,436個一對二和1,352個二對二直系同源基因集，這是可能是由於玉米和摩擦禾擁有相同的全基因組複製情況。看來摩擦草屬和玉蜀黎屬的親緣關係還是很近的。

圖4系統發生樹

紅色、藍色和黑色框分別表示目標物種、背景物種和外參物種。

摩擦草屬基因經歷快速蛋白質序列進化

儘管玉米和摩擦禾親緣關係很近，但是玉米基因展現出的同義替換比例要高於摩擦禾。如果以每年每個位點發生同義替換的速率為6.5×10-9作為速率常數進行計算，那麼摩擦草屬和玉蜀黍屬的分化時間大約在770萬年前。

圖5 物種之間直系同源基因對同意替換速率分布

遊離脂肪酸磷脂代謝的加速進化

那些具有快速進化特徵的基因往往與脅迫反應和磷脂代謝過程有關，與玉米進化相關的基因通常與微管細胞骨架組織，營養庫活性和ATP酶活性有關。在摩擦禾和玉米中Ka / Ks比率的分布中，涉及刺激和脅迫的基因具有非常高的Ka / Ks比率 (> 1)，這與摩擦禾在正向選擇增強非生物脅迫耐受性相一致。

圖6 玉米與摩擦禾之間Ka / Ks比值的分布散點圖

磷脂是一類脂質，它是細胞膜的主要組分，脂質已被證明可以防止在低溫情況下物種的細胞膜損傷，因此膜脂質組成的變化可能是耐冷性所需要的。摩擦禾在磷脂生物合成途徑中的基因使用對數轉換的Ka / Ks值，發現p值顯著高於其他基因背景組 (p-value=3.95e-04) 範圍。相反，玉米基因表現出比背景基因顯著性更低的p值 (p-value=3.08e-03)。比較玉米和摩擦禾中相同基因之間的Ka / Ks值，磷脂生物合成途徑中的基因顯示出比背景基因 (p-value = 4.253e-05) 顯著更高的Ka / Ks比值，說明參與磷脂代謝的基因加速物種進化過程。

圖7 摩擦禾參與脂質代謝基因與其他功能基因之間的Ka / Ks分布

結 論

1. 利用全長轉錄組能夠補充之前無法獲得的信息。

2. 磷脂代謝的基因加速的蛋白質序列進化提供了可行的預測機制，以提高摩擦草屬相對於玉米的耐冷能力。

3. 估計摩擦草屬和玉蜀黍屬的分化時間發生大約770萬年，顯著早於此前報道的450-480萬年。

一場770萬年前的分離，利用全長轉錄組測序分析方法，還原了這段故事的過程，解開了摩擦草屬於玉蜀黎屬的愛恨糾葛，同時也打開了一扇研究物種進化關係的大門！

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