站在前人的肩膀上 CRISPR再獲重要突破：一次切割，糾正上千種突變

「這是一個新的概念：我們不僅找到了治療許多突變的實用方法，而且開發出了一種更少侵入的方法，可以跳過有缺陷的DNA而不是去除它，基因組結構性非常強，其實不需要去除可能很重要的DNA 」。

UT西南醫學中心的一項最新成果研發了一種新的CRISPR基因編輯技術，通過在患者DNA的關鍵點上進行單次切割，可以糾正引發杜氏肌營養不良症（DMD）的3,000種突變中的大多數突變。

這種方法成功地在患者的心肌細胞中進行了檢測，為針對每個引發DMD的基因突變的單個分子治療方法提出了有效的替代方案，也為其他疾病開闢了新的治療途徑，迄今為止，這些疾病還是需要侵入性方法來糾正單基因突變。

科學家表示，這一新方法提高了人類基因組編輯的準確性，糾正了引起破壞性疾病的DNA序列錯誤。這一研究成果公布在Science Advances雜誌封面上。

UT西南大學Hamon再生科學與醫學中心主任Eric Olson博士說：「這是一項重要的進步。我們希望這種技術最終能夠減輕DMD患者的痛苦，甚至挽救生命。」

CRISPR技術改進

杜氏肌營養不良DMD是最常見的致死性兒童遺傳病，由於缺乏抗肌萎縮蛋白（dystrophin），肌肉不斷退化脫力，患兒早年發病後逐漸失去運動能力，通常將在20歲左右死於心臟或呼吸衰竭。目前還沒有辦法逆轉或治癒這種疾病。

DMD由單個基因中的突變引起，這使其登上基因治療的候選名單。然而，dystrophin基因是最大的人類基因之一，長達2300 kb，有79個外顯子，因此，傳統的基因治療方法束手無策，根本不可能將巨大的dystrophin基因包裝到小小的病毒載體中。

為此當CRISPR登場時，科學家們就想到了利用這種技術來治療DMD：2014年，UT西南醫學中心的Eric Olson團隊就使用CRISPR來糾正了DMD小鼠模型中的dystrophin突變。其後在2016年，2017年，Olson博士一直都在進行著技術改進，他們探索了多種可能性，比如利用腺相關病毒（AAV）載體將CRISPR元件導入DMD小鼠模型，刪除錯誤的外顯子，並去除一個移碼突變。他們在幼鼠出生後的不同時間導入載體，發現每種方法都能夠恢復dystrophin蛋白表達，增強心臟和骨骼肌的功能。

踩在這些研究的基石上，最新這一技術實現了導致DMD3,000種類型突變中大多數突變的糾正。而且只需要在患者DNA關鍵點進行一次切割，這比傳統的基因編輯方法更少傷害。

研究人員開發出了12種導向RNA，用於發現沿著肌營養不良蛋白基因的突變「hotspots」，幫助將人心臟肌肉組織中的心臟功能恢復到接近正常水平。

這項研究表明，通過消除基因組DNA中的異常剪接位點，可以在人類細胞中修正大範圍的突變。這些剪接位點會指導遺傳機器構建異常肌營養不良蛋白分子，如果能成功編輯基因，就能表達改善後的蛋白產物，增強肌肉組織的功能。

新的CRISPR-Cas9基因編輯技術改善了DMD患者的心肌細胞功能。從左到右，這些鏡頭顯示了健康的心肌組織，DMD心肌組織和由CRISPR-Cas9編輯的心肌

「實際上，我們發現糾正不到一半的心肌細胞基因，就足以在人體工程學上將心臟組織中的心臟功能恢復到接近正常水平。」文章的第一作者Chengzu Long博士說。

精確編輯

Olson博士研究組花費了大量的時間開發和檢測各種導向RNA，將Cas9酶精確導向12個指定的剪接位點並避免錯誤編輯。這些位點都是有針對性的，因為它們位於沿著dystrophin基因的「hotspots」，沿路上高達60％會發生致病突變。

「這是一個新的概念，」文章的另外一位作者，分子生物學教授Rhonda Bassel-Duby博士說，「我們不僅找到了治療許多突變的實用方法，而且開發出了一種更少侵入的方法，可以跳過有缺陷的DNA而不是去除它，基因組結構性非常強，其實不需要去除可能很重要的DNA」。

單切編輯策略可能對治療其他單基因疾病也有用，Olson博士說。不過如果從蛋白翻譯序列中去除某些外顯子，那麼所涉及的基因必須能夠起作用。

「肌營養不良症就像一個大的減震器，去除一些彈簧圈可以，但要去除其它蛋白也許就不是那麼容易了。」

「真正的希望」

接下來，研究人員將會繼續測試這種方法，確保它不會出現不良的副作用，同時也會尋找提高導向RNA精度的方法。

與此同時，一家新的生物技術公司Exonics Therapeutics Inc.，也成立了，這家公司致力於進一步優化和擴大更多DMD突變以及其他神經肌肉疾病的治療方法。 Exonics已經獲得了UT 西南中心的技術許可。

Bassel-Duby博士說：「這是一巨大的進步，我們提出了許多不同的療法，但是這個療法為延長和改善患者生活質量帶來了真正的希望。」

一些患者已經利用這種方法，糾正了細胞中的缺陷。文章的另外一位作者Jay Schneider博士回憶說，幾年前第一個捐贈細胞的DMD患者，當他坐在輪椅上進入實驗室時，驚訝地看著自己的肌肉細胞進行了糾正性編輯之後敲打培養皿。

「這不僅對於這個病人，而且對整個臨床和科學團隊來說，都是一個令人難以置信的時刻，」Schneider博士說，「把DMD這樣的醫療問題從患者身上帶到實驗室，然後再回到患者身上。這種新的基因編輯技術正在使這一願景變成現實。」

原文標題

Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing

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