「細胞自噬」的前沿文獻彙編
什麼是「細胞自噬」？
2016年度諾貝爾生理學與醫學獎獲獎者為日本科學家大隅良典(Yoshinori Ohsumi)，以獎勵他在「細胞自噬機制方面的發現」。什麼是「細胞自噬」？細胞自噬是細胞組分降解與再利用的基本過程。「自噬」 (autophagy)一詞源於希臘語前綴「auto-」 以及另一個希臘語單詞「phagein」，前者意為「自我」，後者意為「吞食」。因此，自噬作用的意思非常明確，那就是「自我吞噬」（參考文獻1）。
大隅良典與「細胞自噬」
2016年度諾貝爾生理學與醫學獎
「自噬」概念最早出現於上世紀1960年代，當時研究人員發現細胞能夠消滅自身內部物質，方式是將其包裹進一個膜結構中，從而形成小型囊體並被輸運至被稱作「溶酶體」的回收機構進行分解。「自噬」的研究非常困難，直至上世紀1990年代，在經過一系列出色的實驗之後，日本科學家大隅良典利用麵包酵母找到了與自噬作用有關的關鍵基因。隨後他開始致力於闡明酵母菌體內自噬作用的背後機制，並發現與之相似的複雜過程也同樣存在於我們人類的細胞內。大隅良典的研究更新了我們關於細胞物質循環的舊有觀點，他的研究開啟了理解自噬作用在許多生理過程中關鍵作用的嶄新道路，如生物體對於飢餓的適應或者機體對於感染的反應。自噬基因的突變會導致疾病的發生，自噬作用機制在一些類型的疾病，如癌症和神經疾病等病症中也發揮了作用（參考文獻1）。
在最新的有關「細胞自噬」的研究文獻中，我們挑選了五篇文獻，均運用「IncuCyte動態細胞成像技術」從不同側面研究了自噬現象。
文獻一
壹：通過調節IL6的分泌，自噬行為支持乳腺癌幹細胞的維持（Autophagy Supports Breast Cancer Stem Cell Maintenance by RegulatingIL6 Secretion）
（參考文獻2，影響因子4.510）
Abstract
「細胞自噬」是細胞通過降解細胞內物質以提供營養物和能量使之在壓力環境下存活的機能。自噬被認為是癌症幹細胞（cancer stem cell，CSC）或腫瘤觸發細胞（tumor initiating cell）維持的關鍵過程。但自噬是如何支持CSC存活的機理始終不為人知。在本研究中，通過敲除ATG7或BECN1基因來抑制自噬，自噬的抑制可通過調節CD24和IL6的分泌改變乳腺癌細胞里的CD44+/CD24low/-組群。在不依賴自噬生存的乳腺癌細胞系中，自噬抑制增加了分泌到培養基里的IL6的量；而在依賴自噬的細胞系中，自噬抑制降低了IL6的分泌、細胞存活和微球體（mammosphere）的形成。在這些細胞中，對具有自噬能力的細胞進行IL6治療或提供條件培養基可以挽救由於自噬抑制引起的微球體的不足。這些結果揭示自噬可通過調節IL6分泌來調控自噬依賴型乳腺癌細胞的CSC維持，從而揭示自噬是乳腺癌的潛在的治療靶點。
Method
為檢測細胞的增殖和死亡，細胞被種在96孔板中，用IncuCyte系統（Essen BioScience）成像。首次掃描後，加入細胞凋亡Caspase 3/7綠色檢測試劑或YOYO3試劑。培養72h後再加入YOYO3試劑。細胞生長曲線由匯合度計算得到，細胞死亡曲線表達了綠色/紅色熒光匯合度百分比，這些數據均使用IncuCyte的10倍物鏡每4h成像一次得到。在微球體（mammosphere）實驗中，將細胞種在24孔板中。用IncuCyte的全孔成像模式拍攝72h。結果顯示紅色熒光匯合度百分比。
Finding
圖1.依賴於自噬和不依賴於自噬的乳腺癌細胞系的細胞增殖和凋亡。
文獻一
圖1中，不依賴於自噬的MCF7細胞和依賴於自噬的MDA-MB-468細胞用包含自噬作用關鍵基因ATG7或BECN1的shRNAs的慢病毒轉染以敲除自噬基因。NS表示非沉默對照（Non-silencing control），ATG7或BECN1沉默表示自噬被抑制。用IncuCyte成像系統檢測60小時的細胞增殖（實時圖像的匯合度百分比），caspase活化（發出綠色熒光的Caspase 3/7底物的匯合度百分比）和總細胞死亡（同一個圖像中的YOYO3紅色熒光的匯合度百分比）。在圖A中，顯示每三個重複中的代表性曲線。顯示自噬抑制時，在MDA-MB-468細胞中，與MCF7細胞相比，細胞增殖明顯降低，細胞凋亡明顯增加。在圖B中，綠色匯合度（caspase 3-7活性，表示細胞凋亡）曲線的曲線下面積（AUC），或紅色匯合度（用YOYO3表示的總細胞死亡）曲線的曲線下面積（AUC）用增殖曲線的AUC（表示細胞總數）進行歸一化處理。比較自噬缺失的MDA-MB-468細胞（表達ATG7或BECN1shRNAs）和MCF7細胞，顯示在自噬抑制時與MCF7細胞相比，MDA-MB-468細胞發生明顯的細胞凋亡（左圖）和細胞死亡（右圖）。以上圖A和圖B中，不依賴於自噬的MCF7細胞均不受自噬抑制影響。
圖2.自噬調節的IL6的分泌有助於MDA-MB-468乳腺癌細胞系的微球體形成。
文獻一
圖2中，細胞核表達cherry熒光的MDA-MB-468細胞，用非沉默（non-silencing，NS）shRNA或ATG7 shRNA轉染，用IncuCyte拍照評估微球體的形成效率。圖A表示拍攝7天，圖B表示拍攝48h。在圖A中，與對照相比，自噬抑制引起微球體形成的減少。在圖B中，細胞在種植時用IL6處理，或使用從已成功生成微球體3天的非轉染細胞處得到的條件培養基（conditioned media，CM）培養。這兩種處理方法都能有助於MDA-MB-468乳腺癌細胞系的微球體形成。
文獻二
貳：自噬抑制可促進BRAFV600E腦瘤的化療敏感性（AutophagyInhibition Improves Chemosensitivity in BRAFV600E Brain Tumors）
（參考文獻3，影響因子19.453）
Abstract
自噬抑制是癌症的潛在的治療策略，但是人們並不知道可治療哪些腫瘤。BRAFV600E的突變被證實在小兒科中樞神經系統（centralnervous system，CNS）腫瘤中非常重要，也能影響其他類型腫瘤的自噬行為。我們評估了有BRAFV600E突變的CNS腫瘤細胞，發現突變細胞（非野生型）顯示了高概率的誘導的細胞自噬，並對藥物或基因引起的自噬抑制敏感，在臨床使用的自噬抑製劑氯喹（chloroquine）和Raf抑製劑vemurafenib聯合使用，或氯喹與標準化療聯合使用時顯示協同作用。重要的是，我們也證明，氯喹可增進抵抗性體外原代細胞培養中的vemurafenib的敏感性，並第一次證明，向用vemurafenib進行V600E突變的病人體內，加入氯喹可以增加臨床療效。這些發現表明，發生BRAFV600E突變的CNS腫瘤是自噬依賴性的，可以將自噬抑製作為靶點，結合其他治療策略聯合治療。
Method
用IncuCyte進行腫瘤細胞的生長監控。細胞以每孔2000個的密度種植在96孔板上，用IncuCyteZOOM進行培養監控。每孔用10倍物鏡取4個獨立的視野進行成像，成像間隔為4小時。每個實驗做三重複，用匯合度顯示細胞的生長曲線。
Finding
圖3.三種細胞的細胞生長曲線
文獻二
圖3中，圖（C）表達對照組、ATG5 shRNAs和ATG12shRNAs的細胞在標準培養基中生長72小時。用IncuCyte實時動態成像系統得到細胞的生長曲線。數據顯示平均值±SEM。結果顯示：用shRNA轉染敲除ATG5和ATG12基因的BRAFV600E突變的細胞與對照組相比，其細胞增殖降低了，這是因為基因敲除抑制了細胞自噬作用。
文獻三
叄：自噬因子DRAM1和p62可調節膠質母細胞瘤幹細胞中的細胞遷移和侵襲（The autophagy-associated factors DRAM1 and p62 regulate cellmigration and invasion in glioblastoma stem cells）
（參考文獻4，影響因子8.459）
Abstract
多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）的侵略性表現在它在原位的侵襲和對治療的抵抗。在已形成的GBM中，有一類是具有幹細胞特性的腫瘤形成細胞（GBM stem cells, GSCs），被認為導致對治療的抵抗。自噬的代謝通路顯示在GBM的存活的調節中。然而，GBM的自噬狀態和它在癌症幹細胞中的作用還未查明。我們發現，攜帶間葉細胞標記（mesenchymal signature）的GBM腫瘤中，一些自噬的調節子得到高度表達，可以影響其侵略性和侵襲性，這也與MAPK通路的成分有關。這個自噬的標記包括自噬相關基因DRAM1和SQSTM1，編碼一個關鍵的選擇性自噬的調節子p62。高表達的DRAM1與GBM病人的更短的存活期相關。在GSCs中，DRAM1和SQSTM1的表達與MAPK的活化和間葉細胞標記物c-MET的表達相關。DRAM1的敲除降低了p62在自噬體上的定位和它的自噬介導的降解，暗示了DRAM1在p62介導的自噬中的作用。相反的，由飢餓或mTOR/PI-3K抑制誘導的自噬不受DRAM1或p62下調的影響。功能性地，DRAM1和p62調節GSCs中細胞的運動和侵襲。這和能量代謝的改變有關，特別是降低的ATP和乳酸水平。綜合而言，這些發現闡明了自噬在GBM中的作用，並揭示了自噬調節子DRAM1和p62在控制癌症幹細胞的遷移/侵襲中的新的功能。
Method
因為在活躍的侵襲性/遷移性膠質母細胞瘤幹細胞（glioblastoma stem cells，GSCs）中誘導出自噬，我們決定確定是否敲除自噬因子DRAM1和p62會影響細胞遷移和/或侵襲。用IncuCyte實時動態成像儀的細胞遷移模塊（Migration Module）進行成像及分析，記錄劃痕癒合隨時間的曲線，橫軸表示時間，縱軸表示細胞運動的距離。
Finding
圖4. 自噬抑制對細胞遷移能力的影響
文獻三
圖4表示下調自噬調節因子會損害劃痕實驗表達的細胞遷移和細胞侵襲小室實驗表達的細胞侵襲。（a）使用Scramble，shDRAM1.1和shDRAM1.2 G166細胞的劃痕實驗的代表性圖像。圖像通過IncuCyte實時動態成像儀每隔2小時獲取並分析。中間圖像的劃痕癒合曲線顯示細胞遷移進行了長達78小時。右側圖像顯示72小時完成的遷移距離。DRAM1的兩種shRNA序列，與Scramble細胞相比，都能明顯減少劃痕的癒合。（b，c）敲除ATG7和ATG5可以抑制遷移，在（b）中，疊加的曲線顯示敲除ATG7和敲除DRAM1對細胞遷移有相似的影響。而敲除p62（d）沒有顯示對劃痕遷移實驗的影響，可能是由於缺少p62的細胞的生長能力得到了提升，細胞生長是劃痕實驗的干擾因素，因此我們又考察了去除生長因子（GF）的G166細胞的劃痕癒合實驗。（e）在缺少GF的GSCs中，下調p62會得到類似於敲除DRAM1和ATG7的相似的劃痕癒合的降低結果。敲除自噬調節因子會損害缺少生長因子的G166細胞的運動能力。
文獻四
肆：mTORC1的抑制可通過活化MnK/eIF4E通路促進Chikungunya蛋白的翻譯（Inhibition of mTORC1Enhances the Translation of Chikungunya Proteins via the Activation of theMnK/eIF4E Pathway）
（參考文獻5，影響因子7.562）
Abstract
Chikungunya病毒（CHIKV），一種橫跨五大洲的主要傳染病的病原體，是一種正鏈mRNA病毒，利用細胞的cap-dependent翻譯機制進行複製。雖然病毒的感染抑制了mTOR，一種控制cap-dependent翻譯的代謝感測器，病毒蛋白還是被高效的翻譯。用Rapalog進行處理，或將mtor或raptor基因沉默，而不沉默rictor基因，可進一步促進培養細胞中的CHIKV感染。使用生化實驗和實時成像技術，我們證明這種影響與自噬無關或與1型的干擾素生產無關。為提供與我們發現相關的體內實驗證據，我們用mTORC1抑製劑處理小鼠，顯示了致死性增加並顯示對CHIKV的更高的靈敏性。對病毒生命周期的系統評估顯示，抑制mTORC1對病毒蛋白有特別的正面影響，可通過增加結構性和非結構性蛋白的翻譯促進病毒複製。分子分析定義了磷脂醯肌醇-3激酶（PI3K）和MAP激酶活化的蛋白激酶（MnKs）活化的角色功能，導致了eIF4E的過度磷酸化。最後，我們顯示在CHIKV抑制mTORC1的環境下，通過相似的機能，病毒複製優先於宿主翻譯。我們的研究揭示了一個出乎意料的旁路通道，通過該通路，CHIKV蛋白翻譯克服了病毒誘導的mTORC1抑制。
Method
用IncuCyte的實時成像方法測量實驗中的細胞被CHIKV感染的效率。在24孔板和96孔板中，將鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast cells, MEFs）用CHIKV-GFP5』感染，用IncuCyte實時成像系統對報告基因成像。用20倍的物鏡對每個孔中4個獨立的950x760μm2的區域進行以1小時為間隔的成像。培養物保持在37℃，在Thermo的Hera cell 240培養箱中培養，所有實驗三重複。用IncuCyte軟體對GFP+細胞進行計數，結果以每mm2的綠色熒光對象個數表示。將每個孔中的四個視野中的數值進行匯總，並結合三重複算出平均值。IncuCyte的實驗結果還可以製作成錄像。
Finding
圖5.MEFs用CHIKV-GFP感染，用IncuCyte觀察細胞中GFP陽性細胞（報告基因）的個數。
文獻四
圖5（B）是CHIKV-GFP結構的示意圖。缺乏自噬作用關鍵基因的MEFs用CHIKV-GFP（MOI=1）感染，加入Rapamycin （100nM）或TORISEL（0.1mg/ml），Rapamycin和TORISEL均為mTORC1的抑製劑。用實時動態成像儀IncuCyte對GFP陽性細胞進行計數，GFP陽性細胞代表CHIKV感染細胞。圖像顯示GFP染色（綠色對象個數）和曲線顯示了感染的動態過程，相似的結果也在其他7個獨立的實驗中顯示。實驗結果表明mTOR的抑制促進了培養細胞的CHIKV感染，說明mTORC1的抑制可促進病毒蛋白的翻譯，而與自噬無關。
文獻五
伍：在無血清培養的神經膠質瘤細胞中，ABT-888促進替莫唑胺的獨立於MGMT狀態的細胞毒性影響（ABT-888 enhances cytotoxiceffects of temozolomide independent of MGMT status in serum free culturedglioma cells）
（參考文獻6，影響因子3.694）
Abstract
背景：目前的多形性成膠質細胞瘤（Glioblastoma Multiforme, GBM）的治療標準包括分次聚焦的放療和同時進行替莫唑胺（temozolomide, TMZ）化療。一種增加TMZ療效的有前途的治療策略是用聚ADP核糖聚合酶蛋白抑製劑（PARPi）對DNA損傷修復機能進行干涉。目前研究的目標是探索對來源於病人的神經膠質瘤干狀細胞（gliomastem-like cells, GSC）的聯合治療的成果。
方法：在已建立的GBM細胞系U373和T98上檢測聯合治療的可行性。我們開發了一個體外藥物篩選方法，基於來源於原髮型患者組織樣本（n=20）的GSC培養，來評估PARPi（ABT-888）單獨治療的作用和與TMZ聯合治療的作用。治療效果用存活率，雙鏈斷裂，凋亡和自噬實驗檢測，並進行了縱向的顯微細胞監控（IncuCyte）實驗。O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）的狀態用甲基化實驗和western blots的蛋白表達實驗確定。
實驗結果：10μM的PARPi的單獨治療可降低超過25%的細胞存活率，概率是20個GSCs中有4個（20%）。50μM和100μM的TMZ的單獨治療分別對20個GSCs中的12個和14個有效。在100μM劑量中，TMZ抵抗在8個MGMT蛋白陽性培養中的7個中被發現。TMZ治療和PARPi的協同作用在90%的GSCs（n=20）中發現，其中6個是初期抵抗，7個是對TMZ單獨治療敏感。在響應的GSCs中也觀察到增加的雙鏈斷裂誘導和凋亡。雖然統計學上不明顯，但我們注意到一個趨勢，即在western blots和自噬體積聚中都能觀察到自噬的增加。
結論：當同時進行時，PARPi介導的TMZ的協同作用與TMZ敏感性無關，並且可以推翻MGMT（-）介導的抵抗。對聯合治療的反應伴隨著增加的雙鏈斷裂的誘導，與增加的細胞凋亡和自噬一致。加入PARPi可在原代GSCs中和TMZ治療一起協同作用。PARPi可以潛在地增加GBM標準治療的效果。
Method
細胞增殖實驗：用IncuCyte實時動態活細胞成像儀觀察細胞的匯合度，細胞種在96孔板中，放置在IncuCyte中培養，每1-3小時拍攝一張相差圖像，用IncuCyte軟體計算每個孔的匯合度。
雙鏈斷裂實驗：用IncuCyte觀察yH2Ax陽性細胞個數。
細胞凋亡：為檢測單獨治療和聯合治療誘發的細胞凋亡，在加入藥物的的同時加入Essen BioScience公司的Cell Player Caspase3/7 細胞凋亡試劑，稀釋比例1:1000，用IncuCyte FLR記錄加入試劑48小時後的凋亡細胞和總細胞的比例。
細胞自噬：為檢測單獨治療和聯合治療誘發的細胞自噬，我們使用Enzo Life Sciences公司的Cyto-ID自噬檢測試劑盒，它可以提供單丹磺醯戊二胺染料，特異性地對自噬體進行染色。細胞用藥物處理後用IncuCyte FLR觀察，檢測自噬體。在軟體處理過程中，先設定檢測自噬體的熒光強度閾值，再計算每孔的自噬體的個數。
Finding
圖6.PARP抑制會增加TMZ誘導的GSCs細胞的雙鏈斷裂，自噬和凋亡
文獻五
圖6表示（A）聯合治療促進了DSB誘導。計算GSCs，MGMT（+）和MGMT（-）中的yH2Ax陽性細胞個數，作為藥物處理16小時後DSB誘導的指示劑。GS160細胞的結果與非處理對照組對比十分明顯。（B）聯合治療明顯促進了應答GSCs的凋亡誘導，而沒有促進非應答GSCs。用實時成像計算藥物處理48小時後凋亡陽性的細胞個數。在聯合治療後，與單獨治療相比，GSC79細胞的凋亡細胞明顯增加。GS160細胞沒有受到TMZ/ABT-888藥物聯合治療的影響，而正對照能夠成功地誘導凋亡。（C）TMZ和ABT-888可以誘導GS79細胞的自噬，聯合治療增加了這個效應。計算每個孔中的自噬體個數，並和無處理對照對比。藥物處理16小時後讀數。與對照相比，所有治療的自噬體個數都增加。然而聯合治療與用ABT-888或TMZ單獨治療相比，增加不是很明顯。（D）IncuCyte FLR得到的代表性圖像反應了GS79染色的自噬體。請注意細胞內部的熒光斑點的聚集，特別是哪些增大的病變的細胞。（E）在GS79中，與單獨治療相比，聯合治療促進了autophagic flux。加入藥物後24小時做Western blot，顯示LC3-11的積聚，表明autophagic flux的增加。Actin是上樣對照組。
以上5篇自噬研究的代表性文獻都運用了美國Essen BioScience公司的「IncuCyte活細胞動態成像及分析系統」進行實驗研究。
自動化的活細胞動態分析
目前，大部分的細胞檢測方法仍然屬於傳統的終點法——僅僅給出最終結果，這種方法不僅無法對細胞實驗的全過程做出動態的監測和分析，還可能得到有偏差的結果。為了能夠全程的觀測活細胞，美國Essen公司開發了內置於培養箱的IncuCyte S3 「活細胞動態成像與分析系統」，在培養箱內部，同時對6塊細胞培養皿/瓶/微孔板（6-384孔）進行長時間的動態成像，記錄細胞形態細節的實時改變，並通過功能強大的圖像分析軟體轉化為多種細胞功能相關的時間定量曲線。
圖7. IncuCyte S3 活細胞動態成像與分析系統
Essen BioScience
IncuCyte是細胞水平的科研與藥物篩選解決方案，已用於免疫腫瘤殺傷、神經生長及退行、癌細胞轉移、細胞遷移、幹細胞分化、細胞凋亡、細胞壞死、細胞增殖、傷口修復等應用的大規模篩選與長時程生命科學問題的研究。當然，也適用於「細胞自噬」應用。
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上海典奧生物科技有限公司
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參考文獻：
（1）獲得諾貝爾獎的「細胞自噬」是什麼：人類細胞一個重要機制，新浪科技微博，2016年10月3日
（2）Maycotte, P.et.al., Autophagy Supports Breast CancerStem Cell Maintenance by Regulating IL6 Secretion,Mol Cancer Res.,2015
（3）Mulcahy Levy J.M.et.al.,AutophagyInhibition Improves Chemosensitivity in BRAFV600EBrain Tumors,Cancer Discov.2014 July,4(7),pp.773-780
（4）Galavotti,S.et.al., Theautophagy-associated factors DRAM1 and p62 regulate cell migration and invasionin glioblastoma stem cells,Oncogene,2013,32,pp.699-712
（5）Joubert, P.E.et.al.Inhibitionof mTORC1 Enhances the Translation of Chikungunya Proteins via the Activationof the MnK/eIF4E Pathway,PLOS Pathogens,2015, August 28
（6）Balvers, R.et.al., ABT-888 enhances cytotoxic effects of temozolomide independent ofMGMT status in serum free cultured glioma cells,Journal of Translational Medicine, 2015, 13:74
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