IL-10抑制細胞免疫反應機制研究最近進展

IL-10，抑制炎症反應。可以通過下調T淋巴細胞的細胞因子的分泌，下調巨噬細胞、樹突狀細胞MHC II分子和共刺激分子的表達來下調炎症反應。同時又有促進B細胞的增殖、分化和產生抗體的功能，參與免疫調節作用。但是IL-10抑制巨噬細胞、樹突狀細胞和CD8+T淋巴細胞炎症反應的作用機制只到最近才有文獻報道（見下圖）。本文分為兩部分給大家分享這部分研究進展。

一、IL-10抑制LPS誘導巨噬細胞和樹突狀細胞炎症的作用機制

關鍵詞：IL-10;Macrophages;Dendritic cell;糖代謝（Glycolysis）；細胞自噬（autophagy）

1、對巨噬細胞的影響

IL-10調節線粒體功能及糖代謝、促進細胞自噬，抑制LPS誘導的巨噬細胞炎症反應（Science356, 513 – 519（2017））

該團隊使用IL-10基因敲除的小鼠，骨髓體外培養成BMDM，LPS刺激後比較IL10-/-組和WT組的實驗數據來進行研究。

首先是對巨噬細胞糖酵解的影響。LPS作用後發現，IL10-/-組BMDM的糖酵解身升高。GLUT1（glucose transporter）在glucose的轉運過程中發揮重要作用，在LPS的作用下，位於細胞內膜上（intracellularvesicles）GLUT1轉移到細胞外膜上，運輸glucose到胞內，參與糖酵解過程。在缺乏IL-10的情況下，細胞外膜上GLUT1含量增加，同時，RNA-seq數據提示IL10-/-組糖酵解相關的酶轉錄水平上調。提示IL-10通過抑制GLUT1的轉運，影響葡萄糖的跨膜運輸，抑製糖酵解的功能。

其次是對線粒體功能的影響。LPS作用後發現，IL10-/-組BMDM的線粒體（Mitochondria）氧化磷酸化水平下降，ATP產生量減少。使用IL-10作用後，可以改善線粒體功能、氧化磷酸化功能正常。實驗還發現IL10-/-組BMDM線粒體的Mitochondriamass增加，線粒體膜電勢下降，上調線粒體ROS，從而導致功能失常的線粒體（dysfunctional mitochondria）增多。

因為線粒體膜電勢下降、線粒體ROS增多會影響線粒體自噬（mitophagy），從而影響線粒體自噬（mitophagy）對炎症的抑制功能。該現象在IL10-/-組BMDM的線粒體上同樣得到驗證，LPS刺激IL10-/-組BMDM組後，LC3-GFP puncta數量減少，BMDM線粒體自噬減少。使用IL-10處理後，BMDM內LC3-GFP puncta數量基本恢復，線粒體自噬增多。提示IL-10通過提高BMDM的線粒體自噬來抑制BMDM細胞炎症。

mTOR是細胞代謝的關鍵調控因子，mTOR的活化參與調控細胞糖酵解、脂代謝和抑制細胞自噬。使用mTOR抑製劑後，發現WT組和IL10-/-組在LPS作用後，線粒體自噬均未增加。在STAT3基因敲除的BMDM中LPS刺激後，mTOR會持續活化，使用IL-10後，並不能恢復該過程，RNA-seq及Western-blot檢測顯示LPS聯合IL-10處理BMDM組與LPS處理組比較，LPS聯合IL-10處理BMDM組mTOR通路抑制調節蛋白DDIT4轉錄水平和蛋白水平明顯增高。使用mTOR通路抑製劑後，LPS刺激IL10-/-組BMDM細胞，發現線粒體膜電勢和氧化磷酸化水平恢復，失常的線粒體（dysfunctionalmitochondria）數量減少。提示IL-10通過與IL-10R結合後活化STAT3上調DDIT4抑制mTOR通路活化促進線粒體自噬維持線粒體的功能。

除此之外，該團隊還發現，IL-10可以通過抑制mTOR活化，抑制線粒體活化炎性小體（NLRP3/Caspase-1/IL-1β）降低IL-1β分泌和抑制線粒體相關RIG-I通路（RIG-I-like receptor signaling，RLR）的活化降低I型干擾素的表達。

IL-10通過影響糖代謝和自噬抑制LPS誘導的巨噬細胞炎症機制總結如下圖。

2、對樹突狀細胞的影響

IL-10調節糖代謝、緩解LPS對AMPK通路的抑制作用，抑制LPS誘導的樹突狀細胞炎症反應（Blood,2010, 115(23): 4742-4749.）。

該研究使用骨髓體外培養成BMDC，LPS刺激後比較IL10-/-組和WT組的實驗數據來進行研究。

文章發現，LPS作用樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）後，DC細胞糖酵解（glycolyticmetabolism）上調，在LPS刺激的同時添加IL-10，發現IL-10可以抑制LPS對DC細胞糖代謝的影響，使用IL-10R封閉抗體後，IL-10的抑制作用消失。之前有文獻報道，LPS通過活化PIK3-AKT通路，上調糖酵解（glycolyticmetabolism），IL-10可以抑制LPS對PI3K-AKT通路的影響。但是本文發現在樹突狀細胞上，IL-10並沒有抑制LPS對PIK3-AKT通路的活化作用。而樹突狀細胞AMPK通路活化後可以抑制LPS對糖酵解的促進作用，而LPS可以抑制AMPK通路。本文發現使用IL-10後可以解除LPS對AMPK通路的抑制作用。而IL-10本身不可以活化AMPK通路。AMPK通路活化後，可以抑制DC細胞的糖酵解，抑制DC細胞表面共刺激分子CD80、CD86和CD40的表達，以及IL-12和TMF-a的分泌。同時使用AMPK激活劑AICAR處理DC後，也發現LPS刺激DC後，糖酵解上調被抑制。IL-10對樹突狀細胞的作用機制如下圖。

討論及總結：

對比IL-10抑制LPS誘導樹突狀細胞和巨噬細胞炎症機制的研究發現（對比如下表），IL-10對兩種細胞的抑制作用均涉及到對糖代謝的影響，但是對DC來說，作者研究了對AMPK的影響。AMPK通路參與調控細胞內的能量的平衡，可以被LBK1、CaMKK-β、TAK-1以及AMP活化。當體內AMP/ATP值升時，AMPK通路就會活化，抑制細胞內的耗能途徑，如蛋白、脂肪的合成。抑制細胞分裂增殖，凋亡。促進細胞自噬。促進能量產生途徑，如遊離脂肪酸代謝和糖酵解途徑。有文獻報道AMPK通路活化後，可以通過抑制mTOR通路的活化，促進自噬(Nature Cell Biology13.9 (2011): 1016-1023.)。

在DC中，IL-10在緩解了LPS對AMPK的抑制作用後，LPS促進DC細胞糖酵解的能力被抑制。但是IL-10是否通過AMPK調控的DC細胞自噬（Autophagy）進而發揮抑制炎症，文獻並沒有接著研究研究。而最新研究發現，對Macrophages，IL-10不但抑制了LPS促進的糖代謝，維護了線粒體的功能，促進線粒體自噬，進而促進細胞自噬。發揮抑制炎症的功能。所以我們是否可以假設IL-10對DC細胞是不是也有類似的作用機制？

二、IL-10降低CD8+T細胞對抗原的敏感性抑制CD8+T細胞的免疫功能

關鍵詞：IL-10; CD8+T;Antigen sensitivity；Chronic Infection；Virus；T cell exhaustion

IL-10通過上調糖基轉移酶（glycosyltransferase）Mgat5促進N-glycan轉運的細胞外膜上，招募Galectin影響CD8和TCR相互作用，降低CD8+T細胞的抗原敏感性（Antigen sensitivity），從而抑制CD8+T細胞的免疫功能，引發慢性感染（Chronic Infection）（Immunity, 48, 1–14,2018）。

有文章報道HIV或HCV等病毒慢性感染患者體內IL-10水平較高，LCMV Arm病毒珠感染小鼠可以造成小鼠急性感染（Acute Infection），LCMV cl13病毒珠感染小鼠可以造成小鼠慢性感染（Chronic Infection）。慢性感染小鼠IL-10水平升高，使用封閉抗體封閉IL-10Rα後，小鼠慢性感染緩解，體內病毒明顯載量降低。提示IL-10參與調控慢性感染。但是具體機制當時沒有研究。

本研究使用的TCR特異性識別LCMV抗原肽段GP33-41的野生嵌合小鼠或者IL10-/-嵌合小鼠，該小鼠體內含有特異性識別LCMV抗原TCR的CD8+T細胞——P14細胞。該研究分別使用LCMV Arm病毒珠和LCMVcl13病毒珠感染野生型嵌合小鼠8天，造成急性感染或慢性感染。然後取脾臟細胞體外培養，不同濃度抗原肽GP33-41刺激，比較抗原肽GP33-41誘導P14細胞分泌IFN-γ或者TNF-α的EC50（effectiveconcentration 50），來研究P14細胞的對GP33-41抗原敏感性（Antigen sensitivity）。研究發現LCMV cl13病毒造成的慢性感染的EC50明顯高於LCMV Arm病毒珠；說明LCMV cl13組小鼠P14細胞的抗原敏感性和急性感染組比較明顯降低。使用LCMVcl13病毒珠感染IL10-/-型嵌合小鼠8天後，取脾臟細胞體外培養刺激，和野生型嵌合小鼠P14細胞比較，發現抗原肽GP33-41的EC50完全恢復，和LCMV Arm病毒珠一致。干擾IL-10R表達或者使用封閉抗體阻斷IL-10R後，得到同樣的結果。說明IL-10通過降低CD8+T細胞TCR的Antigensensitivity來抑制CD8+T細胞的免疫功能，造成慢性感染。

因為共刺激分子參與了T細胞功能耗竭（T cell exhaustion）。可以抑制T細胞免疫功能。作者比較LCMV cl13感染野生嵌合小鼠或者IL10-/-嵌合小鼠8天後，P14細胞（CD8+T）表面抑制性共刺激分子的表達情況。發現IL-10的缺失並不影響抑制性共刺激分子（PD-1，LAG-3，CTLA-4和Tim-3）的高表達。說明IL-10抑制的T細胞免疫功能並沒有共刺激分子的參與，IL-10和共刺激分子導致的T細胞功能耗竭作用機制不同。

有文獻報道TCR和共受體CD8的相互作用，可以增加TCR識別MHC:抗原肽複合物的親和力（affinity），從而增加T細胞識別抗原提呈細胞提呈抗原肽的敏感性（antigensensitivity）。因此作者進一步研究，發現在LCMV cl13造成的慢性感染中IL-10可以影響TCR:CD8的共定位（co-localization）進而影響TCR下游信號通路的活化。進一步證明了IL-10可以降低CD8+T細胞TCR的Antigensensitivity抑制CD8+T的免疫功能。

文獻報道糖基轉移酶Mgat5可以通過促進N-glycan轉運的T細胞外膜上限制TCR成簇，N-glycan表面有針對galectin高親和力的結合位點。Galectin形成複合物後，影響蛋白的diffusion。本文發現LCMV cl13造成的慢性感染小鼠P14細胞Mgat5表達上調，IL-10可以上調P14細胞Mgat5的表達。而且在瘧原蟲和HCV慢性病人的CD8+T細胞上也發現了MGAT5和IL-10R高表達的現象。因為Mgat5-N-glycan可以招募Galectin到細胞表面，細胞表面Galectin3增多，Galectin3有抑制TCR聚集的功能，本文發現Mgat5上調後細胞表面Galectin3確實增多，文章敲除Galectin3後，發現IL-10降低CD8+T細胞TCR的Antigensensitivity的能力消失，病毒載量被控制。

總結：在病毒慢性感染中，IL-10通過上調Mgat5轉運N-glycan到細胞膜外，進而招募Galentin3，影響CD8和TCR共定位，降低CD8+T細胞的抗原敏感性（Antigen sensitivity）影響CD8+T細胞免疫功能，造成T細胞功能耗竭。該機制與共刺激分子的表達無關。具體作用機制見下圖：

參考文獻：

1、Anti-inflammatory effect of IL-10 mediated by metabolic reprogramming of macrophages.Science356, 513 – 519 (2017) 5 May 2017.

2、Toll-like receptor–induced changes in glycolytic metabolism regulate dendritic cell activation.Blood,2010, 115(23): 4742-4749.

3、Interleukin-10 Directly Inhibits CD8 + T Cell Function by Enhancing N-Glycan Branching to Decrease Antigen Sensitivity.Immunity, 48, 1–14,2018

4、The AMPK signalling pathway coordinates cell growth, autophagy and metabolism .Nature Cell Biology13.9 (2011): 1016-1023.

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