移除衰老細胞可以延緩多種疾病並有望延長人類壽命！

前言

衰老細胞（SnCs）在許多脊椎動物組織中隨著年齡積累，分泌有助於衰老相關的分泌表型（SASP）的因子，並且與年齡相關的病理有關。去除衰老細胞可以延緩多種疾病，延長健康壽命。

衰老和外傷是骨關節炎（OA）的發展的危險因素，骨關節炎是以關節軟骨退化導致疼痛和身體殘疾為特徵的慢性疾病。衰老軟骨細胞存在於接受關節置換手術患者的軟骨組織中，但其在疾病發病機制中的作用尚不清楚。

在這裡，我們通過探究SnCs在OA中的相關作用，提供針對外傷和年齡相關性退行性關節病中的SnCs的治療的新見解。

SnCs對OA的發病發揮作用

我們使用含有p16INK4a（Cdkn2a）啟動子的p16-3MR轉基因小鼠做動物模型，該啟動子驅動含有合成海參熒光素酶（LUC）和單體紅色熒光蛋白（mRFP）結構域的融合蛋白的表達，以及驅使形成單純皰疹病毒1胸苷激酶（HSV-TK）的截短形式。GCV通過針對HSV-TK特異性去除衰老細胞。（Supplementary Fig. 1a）

分三組（非手術組、假手術組、ALCT組）先對轉基因小鼠關節區行熒光檢查（Supplementary Fig. 1b）

ALCT後的轉基因小鼠熒光強度增強，表明小鼠關節損傷後SnCs增多了。且在14天左右熒光強度升至峰值，接著逐漸下降至一個低水平，但仍比sham組高，考慮組織天生有對SnCs的消除作用，但損傷後很難自愈。

Cdkn2a的mRNA水平（Fig. 1c and Supplementary Fig. 1c）

Cdkn2a的mRNA水平與熒光動力學改變相似地先升高後減低。再次證明了SnCs在ACLT後的相應變化過程。

編碼SASP標誌物IL-6的Cdkn1a 和 Il6的mRNA水平（Supplementary Fig. 1d）

Cdkn1a 和 Il6的mRNA水平在創傷後均升高，Cdkn1a更明顯。第三次證明了SnCs在ACLT後是增加的。

小鼠關節的番紅O和甲基綠染色(Supplementary Fig. 1e)

ACLT後軟骨變薄，關節表面不平整，以及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原纖維的丟失，從組織學證明ACLT後OA進展、軟骨退變。且非轉基因小鼠GCV處理後無改變，說明SnCs與ACLT後OA發病的相關性。

通過病患側與對側肢體的負荷重量的百分比以及置於55°C熱板小鼠的反應時間來評估小鼠損傷相關疼痛程度(Supplementary Fig. 1g)

ACLT後患側負重減少，置於55°C熱板的反應時間增長，表明患側疼痛增加，從疼痛評估角度證明ACLT後OA進展、軟骨退變。同時非轉基因小鼠GCV處理組患側負重較轉基因小鼠GCV組未改善，反應時間未縮短，再次說明SnCs與ACLT後OA發病的相關性。

對p16INK4a蛋白質和HMGB1（其核表達優於細胞中SASP組分的分泌）進行免疫染色，定位SnCs (Fig. 1e,f)

Veh組p16INK4a蛋白主要限於表面區域，其中66％的細胞對於表現p16INK4a陽性，並且在關節軟骨中有65％的細胞沒有核HMGB1染色，表明ACLT後SnCs增多且多附著於軟骨表層，提示SnCs與組織退變的相關性。

以上這些結果表明ACLT後小鼠關節處OA相關癥狀加重，同時SnCs增多，證明SnCs對ACLT後OA發病起作用。

為了驗證選擇性清除SnCs是否可以減輕甚至逆轉OA的發病及其癥狀，我們用針對HSV-TK選擇性殺傷細胞的更昔洛韋(GCV)處理ACLT後的轉基因小鼠（fig.1a）分三組（假手術組，對照組，實驗組），在第28天進行評估。

ACLT小鼠的熒光圖像 (Fig. 1b)

Veh組較sham組熒光增強，說明創傷後衰老細胞增多，且28天時強度較14天時要高，考慮衰老細胞自然降解可能；而GCV組28天時熒光強度較Veh組減弱，表明GCV處理增強了對p16INK4a陽性的衰老細胞的消除作用。

Cdkn2a 和Cdkn1a mRNA水平(Fig. 1c,d)

結果：損傷介導Cdkn2a 和Cdkn1a mRNA水平升高， GCV處理後mRNA均減少再次證明了GCV的消除作用。

小鼠關節的免疫染色（Fig. 1e、f），同時對脛骨平台內關節做OARSI評分（Fig. 1g）

通過四組對比可以說明GCV處理導致HMGB1蛋白增多，p16INK4a 蛋白質減少，更接近於sham和NC組，第三次說明GCV對SnCs的清除作用；同時番紅O和甲基綠染色表明清除SnCs改善了軟骨變薄，關節表面不平整，以及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原纖維的丟失。OARSI評分再次表明清除SnCs改善了骨關節炎病情。

通過病患側與對側肢體的負荷重量的百分比以及置於55°C熱板小鼠的反應時間來評估小鼠損傷相關疼痛程度。（Fig. 1h）

表明清除SnCs減弱了損傷相關疼痛程度。

OA組織降解特徵性的Mmp13和Il-1β表達水平（Fig. 1d）

表明清除SnCs減少了炎性標記物的表達。

Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖相關的Col2a1和 Acan的蛋白質和mRNA水平（Fig. 1e）

表明清除SnCs增加了Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的合成，促進了軟骨細胞外基質形成。

骨贅和脛骨內側骨評分，骨鈣素染色，骨形成標誌物Runx2 和 Bglap以及骨轉換標誌物Ctsk, Rankl, 和 Opg的mRNA測定。(Supplementary Fig. 2b–d)

ACLT手術後明顯骨贅增生，軟骨下骨骨丟失，表現骨鈣素陽性的成骨細胞在脛骨軟骨下骨骨髓區內異常增加，骨吸收相關基因表達增加。而GCV清除SnCs後未明顯改善這些異常改變，考慮GCV在關節內注射時不能到達骨頭，可能需要全身施用。

最後為了證實GCV本身不影響局部軟骨環境，但僅殺死p16-3MR小鼠中的SnCs，我們將GCV注射到非轉基因C57BL小鼠經ACLT處理的關節中，測OA相關基因表達和疼痛測試。（Supplementary Figure 1d，g）

通過轉基因小鼠GCV處理組可以證明SnC去除增加了Col2a1和Acan的蛋白質和mRNA水平（分別對應於軟骨細胞外基質分子II型膠原和聚集蛋白聚糖），而調節軟骨形成的Sox9的表達保持不變。同時非轉基因GCV組各指標與Veh組相接近，表明GCV本身不影響局部軟骨環境。

以上這些結果證明了GCV可以清除衰老細胞，同時衰老細胞的清除減弱了損傷相關疼痛程度，減少了炎性標記物的表達，促進了軟骨細胞外基質形成，改善了骨關節炎病情。

接著證明不以HSV-TK為靶向的最近發現的衰老細胞選擇性清除藥物UBX0101能夠清除SnCs。

首先通過p16-3MR小鼠和與用於施用GCV的注射方案類似的注射方案來優化UBX0101的濃度。

先通過熒光來比較UBX0101和 GCV清除SnC的功效。 (Supplementary Fig. 3a，Fig. 1b)

確定UBX0101以0.2 mM的濃度可以有效清除SnCs。

然後通過Cdkn2a, Cdkn1a, Mmp13和Il1b的表達減少證明UBX0101對SnCs的清除作用。(Supplementary Fig. 3b)

關節軟骨侵蝕的染色塗片和疼痛評估(Supplementary Fig. 3c–e)

UBX0101清除SnCs後的效果與GCV處理後相似。

再測Col2a1、 Acan、 Sox9 和 Runx2的表達(Supplementary Fig. 3b)

促軟骨生成的Col2a1 和Acan表達增多提示UBX0101清除SnCs後有新鮮軟骨生成；而調節軟骨細胞肥大和骨生成的Sox9 和 Runx2未明顯改變。

UBX0101對異常軟骨下骨丟失和骨贅形成的作用與GCV相似，未明顯改善。(Supplementary Fig. 3f)

以上這些結果證明UBX0101在轉基因小鼠中可以清除SnCs，且清除SnCs後的效果與GCV處理後相似。

然後探究關節內注射UBX0101對非轉基因C57BL小鼠的作用效果（Figure 2a）

先通過HMGB1、Ki-67、PCNA、p16INK4a、Cdkn2a, Cdkn1a, Il6和 Mmp13的相應表達證明UBX0101對SnCs的清除作用。(Fig. 2b,c,d and Supplementary Fig. 6a)

再通過長達84天的軟骨退變情況和OA癥狀觀察，證明UBX0101清除SnCs對緩解軟骨退變、改善OA癥狀的長期效果（Supplementary Figs. 7c and 8b）

同時UBX0101清除SnCs可以緩解疼痛（Supplementary Figs. 8c）

接著通過促軟骨生成因子Col2a1的變化證明UBX0101清除SnCs可以促軟骨發育（Supplementary Figs. 7a和8d）

然後通過骨贅和脛骨內側骨評分（28天、56天、84天）、骨鈣素染色、Runx2, Bglap, Ctsk, Rankl 和Opg的mRNA定量（28天、56天）（Supplementary Figs. 7b–d and 8d,e）

證明UBX0101清除SnCs未明顯改善軟骨下骨病變

以上這些結果證明UBX0101在非轉基因C57BL小鼠中可以清除SnCs，且清除SnCs後的效果與GCV處理後相似，同樣減弱了損傷相關疼痛程度，減少了炎性標記物的表達，促進了軟骨發育，改善了骨關節炎病情。

接著測試UBX0101對更晚期OA的潛力(Supplementary Fig. 9a)

HMGB1核染色的非衰老細胞增加（Supplementary Figure 9.b）

疼痛緩解（Supplementary Figure 9.c）

Cdkn2a, Cdkn1a and Mmp13 mRNA水平降低（Supplementary Figure 9.d）

Col2a1和 Acan表達增加，蛋白多糖染色增多（Supplementary Figure 9.d，e）

軟骨下骨硬化緩解，但骨贅未改善（Supplementary Figure 9.f）

這些結果說明UBX0101選擇性清除SnCs對更晚期OA有作用。

利用INK-ATTAC轉基因小鼠探究選擇性清除年齡相關的SnCs對關節炎發展的影響。

該品系小鼠在p16INK4a啟動子的控制下表達FK506結合蛋白-caspase-8融合蛋白，而AP20187是一種誘導p16INK4a表達細胞凋亡的分子，藉此即可選擇性清除SnCs（Figure 3.a）

軟骨染色，OA評分

選擇性清除年齡相關的SnCs增加了蛋白多糖及軟骨厚度，顯著減少了軟骨退變。

以上結果證明選擇性清除年齡相關的SnCs可以顯著緩解軟骨退變，緩解OA病變。

探究年齡與創傷的協同作用是否更加劇了關節病變，以及選擇性清除SnCs的效果

做關節熒光圖像

高年齡Veh組隨時間延長，熒光強度越高，說明高年齡組自身清除SnCs的能力減弱，SnCs增多。

再測Cdkn2a, Cdkn1a和 Il1b mRNA水平，Ki-67陽性細胞計數

更高的Cdkn2a, Cdkn1a和 Il1b mRNA水平，更少的Ki-67陽性非衰老細胞再次證明高年齡組SnCs的變化。

接著做關節組織染色

高年齡組中SnCs分布與低年齡組有區別，40%表現p16INK4a陽性的SnCs遍布軟骨中而非表面。從組織染色可看出高年齡組OA更嚴重，評分更高。

高年齡組選擇性清除SnCs後同樣緩解了疼痛，減少了Cdkn2a, Cdkn1a, Il6 和Mmp13的表達；而且Cdkn1a 、IL-6和 Mmp13藥物處理組比非手術組更低，表明高年齡組在非手術情況下基礎SnCs水平較高。

Col2a1 和 Acan並未明顯改變。

高年齡組選擇性清除SnCs對骨贅形成、軟骨下骨重塑，骨鈣素生成影響不大。

這些結果表明年齡和外傷對OA發展具有協同作用，加劇OA進展；同時UBX0101一樣可以選擇性清除高年齡小鼠中的SnCs，但清除SnCs的正向作用被隨年齡減弱的軟骨細胞增殖能力所抵消。提示在處理高齡自然發生的OA時需要額外的治療和潛在的全身治療以減輕疾病並重建軟骨組織。

再然後通過接受全膝關節置換的OA患者中分離的軟骨細胞的體外培養物探究在臨床OA中SnCs的相關性。

以正常軟骨和OA軟骨做對比進行SA-β-gal染色和免疫組化

圖不能說明太多問題，從不同關節區域分離的培養物染色各不相同，為了消除偏離率，我們從培養物中分離出單層軟骨細胞做進一步研究。

最後利用體外培養物分離出的單層軟骨細胞探究UBX0101選擇性清除SnCs後的效果。

通過SA-β-gal染色，HMGB1免疫熒光，Annexin V–propidium iodide (PI) live–dead細胞染色，P21蛋白定量

表明UBX0101殺死了20% SnCs 和不超過5% 的nonSnCs，再次證明了UBX0101對SnCs的選擇性殺傷作用。

通過活化caspase-3的WB

證明UBX0101 在OA患者關節中殺傷 SnCs與凋亡途徑有關，但在正常組織中無殺傷作用。

UBX0101處理後CDKN2A, MMP3 ，IL6， MMP13 和 IL1B表達均下降，再次證明UBX0101對SnCs的殺傷作用，而消除SnCs緩解了OA相關基因表達。

UBX0101消除SnCs 增加了剩餘軟骨細胞的增殖速度。

最後探討在3d顆粒培養體系中UBX0101對SnCs的消除作用及其效果

UBX0101處理後SA-β-gal活性減弱，CDKN2A, MMP3, IL1B 和 IL6 mRNA水平降低，COL2A1和 ACAN mRNA水平提高；p16INK4a 和MMP13蛋白質水平提高，COL2A1, 蛋白多糖和sGAGs水平上升。

以上這些結果說明UBX0101對人OA關節的衰老軟骨細胞具有選擇性清除作用，該清除作用與誘導衰老細胞凋亡有關。而且清除作用減少了OA相關基因表達，加快了正常軟骨細胞增殖速度，並且在3D顆粒培養體系中顯著減少了炎性標記物的表達，促進了發育，改善了骨關節炎病情。

全文結論：我們發現在ACLT後，小鼠關節軟骨和滑膜中累積了SnCs，選擇性消除這些細胞減弱了ACLT後OA的發展，減輕了疼痛並增加了軟骨發育。在轉基因，非轉基因和老年小鼠關節內注射選擇性殺死SnC的降解分子驗證了這些結果。從接受全膝關節置換的OA患者中分離的軟骨細胞的體外培養物中選擇性清除SnCs減少了衰老和炎性標記物的表達，同時也增加了軟骨組織細胞外基質蛋白質的表達。衰老細胞表達包括炎性分子和降解酶的SASP。 通過轉基因小鼠模型或藥物干預去除SnCs延緩了外傷後OA和相關疼痛的發展，並且改善了成軟骨環境。這些發現提供了針對用於治療外傷和年齡相關性退行性關節病的SnCs的治療的新見解。

參考文獻：

Jeon, O.H., et al., Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nat Med, 2017. 23(6): p. 775-781.

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