高大明組揭示mTOR影響基因組穩定性的分子機制—王平、黃俊點評

生物個體基因組完整性的維持得益於細胞內完善的DNA修復機制。當生物體受到內外界刺激而引起DNA損傷時，細胞會啟動快速而準確的修復機制【1,2】，以避免細胞凋亡、衰老等不可逆轉的不良後果。DNA損傷中最為危險一種是DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）。如不能及時修復，DSBs會導致染色體片段缺失、易位等嚴重的基因組缺陷，從而可能導致細胞惡性轉化為腫瘤細胞。Robert A.Weinberg教授2011年在《Hallmarks of Cancer: The Next Generation》一文中將基因組不穩定性列入腫瘤十大特徵之一（下圖）。

mTOR（mechanistic target of rapamycin）對細胞穩態有重要的調節作用，在蛋白定位、糖脂代謝、細胞生存和自噬方面也有很重要的作用【3】。在細胞外生長信號（如氨基酸，胰島素等）的刺激下，mTOR的2個複合體形式——mTORC1和mTORC2，通過直接或者間接的方式激活下游一系列激酶，如核糖體S6激酶（S6K），絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT），蛋白激酶C（PKC）等，最終作用到底物上並引發一系列的生物學效應。因此，mTOR在感知細胞外生長信號並做出應對方面發揮了很重要的作用。最近，越來越多的研究表明，mTOR和它的上游抑制蛋白LKB1和基因組穩定性有關【4-12】，但其具體機制仍不是很清楚。

日前，中科院生化細胞所/分子細胞科學卓越創新中心高大明研究組在Nature Cell Biology雜誌上以Articles的形式發表了題為「The mTOR-S6K pathway links growth signaling to DNA damage response by targeting RNF168」的研究論文，該研究發現細胞生長信號mTOR-S6K通路通過E3泛素連接酶蛋白RNF168來調控DNA損傷修復，首次將生長信號與DNA損傷修復聯繫起來，並闡明了相關作用機制。鑒於該工作對mTOR以及DNA損傷修復領域的重要創新意義，BioArt特別邀請到了同濟大學王平教授和浙江大學黃俊教授點評，以饗讀者！

細胞在發生DSB後，會啟動損傷修復應答（DNA damage response, DDR）機制。ATM（ataxia-telangiectasia mutated）感知DNA損傷後磷酸化組蛋白H2A產生γ H2A.X。隨後，介導DNA損傷檢測蛋白1（mediator of DNA damage checkpoint protein 1, MDC1）先後招募E3泛素連接酶RNF8和RNF168蛋白，開始並放大泛素化組蛋白的信號。以上的步驟使得53BP1和RAP80-BRCA1複合體招募下游信號分子並啟動NHEJ（non-hommologous end joining）和HR（homologous recombination），修復受損的DNA，維持基因組的穩定性【13-16】。RNF168在上述過程中發揮了節點的作用，其功能的穩定對下游修複信號的傳遞有很重要的作用。

在最新的這項研究中，研究人員發現，加入氨基酸（AA）的MEF在etoposide（一種拓撲異構酶抑製劑，能夠誘導DNA損傷）或者IR（ionizing radiation）處理後，細胞的修復變慢。由於AA可以激活mTORC1和下游的S6K7【17】，所以研究人員猜測可能是mTORC1-S6K通路影響了DDR。敲減MEF細胞內的S6k基因後，細胞的修復變快，對53BP1蛋白的招募也加快。S6k基因回補實驗也證實了這一點。

由於RNF168在DNA損傷修復過程中，對泛素鏈的延伸有重要的作用【13,16】，所以研究人員猜想mTORC1-S6K是否是通過RNF168來影響DDR，RNF168是否存在修飾？質譜鑒定，RNF168-S60位的絲氨酸是唯一一個響應AA刺激而升高的磷酸化位點。通過體內體外實驗驗證了mTORC1-S6K1通路的激活可以促進RNF168-S60位的磷酸化。

RNF168-S60磷酸化後對RNF168的功能產生什麼影響呢？體內細胞和體外激酶實驗證明，RNF168-S60位的磷酸化主要是減弱其自身的E3連接酶活性，對其釋放E1/E2複合體的能力沒有影響。另一方面，RNF168-S60的磷酸化促進了TRIP12對RNF168蛋白的降解【18】，使RNF168更加不穩定。

研究人員還用CRISPR-Cas9技術構建了knock-in小鼠，分離出原代MEF。通過IR-免疫熒光、免疫組化染色、CSR（class-swith recombination）等實驗，進一步驗證了生理條件下，RNF168-S60磷酸化（RNF168-SE突變模擬磷酸化）後，小鼠的DNA損傷修復功能受限，出現諸如LPS刺激後免疫球蛋白類別轉換重組能力減弱，小腸絨毛在輻照損傷後再生變慢等現象（下圖），更加直接的驗證了RNF168-S60位的磷酸化損害了DNA損傷修復的功能。

knock-in小鼠RNF168-SE（模擬磷酸化）小腸絨毛在輻照損傷後再生變慢等現象（右下）

LKB1一直被認為是mTORC1-S6K的上游，通過磷酸化AMPK和很多其它的底物來發揮作用【19】。在LKB1基因突變的腫瘤中， mTORC1的超常激活被認為是驅動腫瘤發生的重要因素【19,20】，所以研究人員猜測LKB1基因的缺失會不會也對RNF168的表達、活性、以及DDR有影響。

研究發現，在MEF細胞中LKB1基因敲減以後，RNF168蛋白表達量下降、半衰期縮短、DNA損傷修復延長。如果將LKB1回補到Lkb1-/- MEF細胞中，DNA損傷觸發的組蛋白泛素化信號增多，DNA損傷修復功能恢復。提示在腫瘤細胞中，LKB1基因缺失，引起的mTORC1-S6K通路的激活，是可以通過RNF168來影響DDR，進而影響基因組穩定性的。有意思的是，通過在Lkb1-/-MEF中表達RNF168-SA和RNF168-SE突變體發現，RNF168-SA可以回補因Lkb1缺失而造成的DDR缺陷，增強53BP1蛋白的招募，抑制因IR造成的細胞死亡。

同樣的，在經典的KrasG12D/Lkb1L/L小鼠原發肺癌模型中，通過外源表達不能被磷酸化的RNF168-SA突變體，可以有效抑制LKB1缺失誘發的腫瘤的發生。

綜上，這項研究闡明了在胞外生長信號的刺激或胞內LKB1等抑癌基因突變的情況下，活化的mTORC1-S6K1通路，通過磷酸化RNF168第60位絲氨酸，抑制其E3活性並促進其蛋白降解，進而影響DDR及基因組穩定性，最終促進細胞惡性轉化及癌症發生的分子機制（下圖）。

細胞外生長因子通過RNF168對DNA損傷修復產生影響

本研究首次將細胞外生長信號與細胞內的DNA損傷修復/基因組穩定性聯繫起來，為更好的理解mTORC1激活驅動的腫瘤發生機理提供了依據，也為更好的治療腫瘤提供了新思路。

據悉，謝小多博士、胡弘曆博士、童欣媛博士、李龍博士為本文的共同第一作者，高大明研究員為本研究的通訊作者。該研究還得到了中科院上海生化細胞所季紅斌研究員、孟飛龍研究員、胡榮貴研究員，曾嶸研究員、黃晶研究員、中科院上海生科院（人口健康領域）秦駿研究員、中科院上海藥物所周虎研究員、 OrigiMed 秦公煒博士，以及哈佛大學醫學院魏文毅教授等的大力支持。

專家點評：

王平（同濟大學醫學院教授、國家「傑青」）

Comments：mTORC1信號通路作為細胞內感應微環境的感測器，受到氨基酸、生長因子、能量等信號的精細調控。已有的研究表明mTORC1能夠通過多種接頭蛋白對細胞內的各種生理生化反應進行精細的調控。激活的mTORC1的能通過一系列下游效應蛋白來調控多種細胞生物學功能，包括：蛋白質的合成、脂質的合成、核苷酸的合成以及細胞自噬等過程。mTORC1與腫瘤密切相關，近年來的諸多研究特別是通過原發腫瘤模型證實，該通路的上游信號分子突變或異常，比如PTEN 、LKB1等是腫瘤發生的重要原因。但是一個有趣的問題是，腫瘤的發生通常是由基因組不穩定/DNA突變所引發，而mTORC1信號通路作為感知營養-能量的主要調控者，其活化如何引起或促進基因組不穩定、從而導致細胞惡性轉化為腫瘤細胞的機制非常不清楚。

蛋白激酶S6K是mTORC1的重要效應蛋白，能磷酸化S6和EPRS等蛋白，進而調控蛋白質和脂質等合成過程。在最新發表在Nature Cell Biology的研究，來自中科院上海生化與細胞生物學研究所的高大明課題組聚焦在mTORC1-S6K信號通路與DNA損傷修復過程。非常有趣的是，他們發現氨基酸信號能夠調控DNA損傷修復。在進一步的研究當中，他們發現DNA損傷修復的關鍵蛋白RNF168是S6K的重要底物。

已知RNF168作為E3泛素連接酶，能夠通過催化DNA雙鏈損傷位點形成Lys63連接的多聚泛素鏈，募集相關效應蛋白BRCA1和53BP1等對DNA損傷進行修復。在高大明課題組的這項研究中， 他們提供了充足的證據證明S6K能夠促進RNF168第60位的絲氨酸發生磷酸化修飾；更為重要的事，通過CRISPR- Cas9構建的RNF168的模擬非磷酸化突變體（RNF168-S60A）和RNF168的模擬磷酸化突變體（RNF168-S60E）小鼠，揭示該位點的磷酸化修飾對DNA損傷修復的重要性。進一步的機制解析發現，mTORC1-S6K介導的磷酸化修飾不僅能夠調控RNF168的E3泛素連接酶的活性，還能夠調控該蛋白的穩定性。

DNA的損傷如果得不到及時修復會引發基因組的不穩定性，並誘發諸如癌症、免疫缺陷等重大疾病。這項研究進一步發現在KrasG12D/Lkb1L/L非小細胞肺癌小鼠模型中，RNF168-S60A能夠有效抑制自發腫瘤的形成。這一結果證明mTORC1-S6K通路對RNF168介導的DNA損傷修復過程的抑制作用，在活化的mTORC1通路所誘發的腫瘤中的重要功能。

該項研究提供了大量的充足的證據，揭示了mTORC1-S6K信號通路的全新功能，鑒定該通路的新底物RNF168，建立了細胞外的氨基酸與生長因子等微環境信號可能通過mTORC1-S6K-RNF168信號軸促進基因組不穩定性的新模型，為研究機體營養過剩/代謝狀態異常與腫瘤發生之間的關係提供了新的思路。

黃俊（浙江大學生命科學研究院教授，國家「傑青」）

Comments：DNA損傷應答反應(DNA damage response, DDR)對於維持基因組穩定性至關重要。泛素連接酶RNF168作為DDR途徑中的核心蛋白，被招募到DNA損傷位點，對單泛素化的組蛋白H2A及H2AX進行多聚泛素化修飾，進而招募53BP1和RAP80-BRCA1及其下游蛋白對受損的DNA進行修復。由於RNF168在維持基因組穩定性方面發揮的重要功能，rnf168突變將造成RIDDLE綜合征(RIDDLE syndrome)。越來越多的證據顯示生長信號影響著基因組穩定性，但是兩者之間的聯繫尚不明確。

高大明研究組的最新工作首次揭示了mTORC1-S6K信號通路抑制了RNF168的功能而導致基因組的不穩定，揭秘了能量代謝和基因組穩定性之間的直接聯繫。該團隊發現參與細胞能量代謝的mTORC1-S6K激酶磷酸化RNF168的Ser60，一方面抑制了RNF168的泛素連接酶活性，一方面促進了泛素連接酶TRIP12與底物RNF168的相互作用，加速RNF168的降解。RNF168 Ser60的磷酸化修飾導致DNA損傷後組蛋白H2A和H2AX的泛素化修飾顯著降低，抑制了DDR的發生。此外，該研究組還發現腫瘤抑制因子LKB1通過抑制mTORC1的激酶活性來維持RNF168的穩定性，保證了DDR的順利進行，維持了基因組的穩定性。他們在LKB1缺失的細胞中表達RNF1680-S60A的突變能維持其蛋白穩定性和泛素連接酶活性，重啟DDR；並且在老鼠的非小細胞肺癌模型上證實缺失了LKB1極易產生腫瘤，而表達RNF168-S60A能有效地抑制腫瘤的發生。這些實驗數據表明LKB1抑制腫瘤的形成很大程度上歸功於它拮抗mTORC1-S6K對RNF168 Ser60的磷酸化修飾。高大明團隊的研究成功地揭示了mTORC1-S6K能量代謝途徑通過抑制RNF168的功能來負調控DDR而造成基因組的不穩定，首次揭秘了這兩條重要信號通路之間的連接橋樑，並且為缺失腫瘤抑制因子LKB1的腫瘤患者提供了新的治療方案。

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