高效且靶向特異性的 CRISPR 基因敲低技術在大腦研究中的多樣性應用

2018 年 2 月 5 日，《自然 - 神經科學》（Nature Neuroscience）以 Technical Reports 的形式在線發表了由清華大學姚駿課題組和中科院北京基因組所米雙利課題組合作完成的題為 CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain 的研究論文，報道了他們建立的在動物腦內進行基於 CRISPR interference (CRISPRi)的多重基因條件性敲低平台，為在體研究複雜蛋白複合物的功能和多基因神經疾病的發病機理提供了重要的工具。

基因特異性的失活策略是神經生物學研究的重要方法，對於闡釋基因在神經系統中的基本生物學功能不可或缺。隨著神經科學的高速發展，單一基因的敲除 / 敲低逐漸不足以滿足研究者的要求。尤其是對於複雜的多蛋白複合物和多基因神經疾病，多重基因元素失活的條件性組合搭配正日益成為主流需求。然而，逐一構建不同基因的敲除 / 敲入動物模型再進行雜交，一直受限於低下的製備效率、冗長的製作周期和昂貴的成本費用，成為了實際研究中的主要瓶頸之一。因此，快捷簡單地操作大腦中的基因表達的方法亟需建立。

CRISPR/Cas9 基因編輯工具已被廣泛用於建立轉基因細胞株和動物模型。然而，該技術目前在神經科學中的應用還很局限。一方面，神經元的不可分裂的特性決定了無法以建立細胞系的方式來研究特定基因在神經元中的功能。另一方面，CRISPR/Cas9 切割後產生的非同源末端連接修復常常導致非特異性的刪除、插入或其它突變，導致在單細胞水平產生多種表型變化，例如雜合型、純合失活型和野生型等，將可能對後續實驗產生不必要但卻可能是非常嚴重的干擾。

在這項研究中，作者利用病毒傳遞策略，針對神經元構建了優化的基於 dCas9 的 CRISPRi 系統，達到在小鼠腦內進行高效且靶向特異性的抑制功能基因表達的目的。該系統不但在單細胞水平獲得均一的表型，而且在基因沉默水平上顯著優於傳統的 RNAi 技術。利用 sgRNA 相隔錯配的「釣魚」策略，作者進一步證明基於 dCas9 的 CRISPRi 技術在神經元中具有精確的靶向特異性，幾乎不會產生脫靶效應。因而，針對神經元特異的 CRISPRi 技術可用於快速地構建腦內基因特異性敲低的動物模型，能夠大大縮短了研究時間和花費。

作者進一步拓展該技術在動物腦內的應用，利用神經元亞群特異性的啟動子條件性控制功能基因 Syt1 在海馬齒狀回興奮性和抑制性神經元中的獨立失活，以達到雙向調節局部神經網路的興奮 / 抑制平衡的目的。分子生物學和電生理學實驗證明，條件性 CRISPRi 能精確控制 Syt1 基因在特定類型神經元中喪失功能而不影響 Syt1 在其它類型細胞中的表達。進一步的動物行為學測試表明，上調或下調齒狀回神經網路的興奮 / 抑制平衡，使得小鼠學習記憶能力出現相應的雙向變化；然而，無論是平衡朝哪個方向移動，小鼠均表現出抑鬱和焦慮行為。這些基於條件性 CRISPRi 的實驗結果表明，海馬區對於動物學習記憶和精神活動的調節具有完全不同的機制。最後，作者建立了靶向 Syt1 及其互作蛋白網路的基因 Syb2,Stx1a/ b 和 SNAP25a 的五重基因 CRISPRi。這一測試採用兩種不同的策略，分別是：1）多種聚合酶 III 型啟動子獨立驅動的 sgRNA 表達框和 dCas9-KRAB 共表達的一體化載體系統；2）串聯表達的同種聚合酶 III 型啟動子驅動 sgRNA 表達框與 dCas9-KRAB 獨立表達的雙載體系統。實驗證明，這兩套系統都能夠在小鼠腦內實現靈活多變的多基因不同組合的高效失活。因此，針對神經元的 CRISPRi 能夠靈活地實現小鼠腦中複雜基因網路的條件性調節。

本文作者的一系列實驗證明，基於病毒傳遞策略的 CRISPRi 工具，能夠在動物出生後的各個階段，包括在生理及病理狀態下實現在體操作，建立神經元和動物模型，從分子到細胞，從環路到行為，解析多重基因和複雜表型之間的關聯，探索複雜腦疾病的致病機制，並在此基礎上尋求新型有效的治療策略。因而，該研究工作為神經生物學研究提供了靈活而多樣的基因操作工具。

清華大學生命學院 PI 姚駿和中科院北京基因組所米雙利研究員為本文共同通訊作者，清華大學生命學院博士後鄭毅和沈偉為本文共同第一作者，中科院北京基因組所張健和清華大學生命學院劉要南等博士生為本工作做出重要貢獻。本研究得到了鍾毅教授和清華大學時松海教授、美國 Salk 研究所 Fred Gage 教授和 Patrick Hsu 教授的大力協助。本工作獲得了膜生物學國家重點實驗室、科技部重點研發專項、國家自然科學基金、青年千人計劃基金以及生命科學聯合中心的經費支持。

圖 1. CRISPRi 在小鼠腦內進行條件性敲低和多重敲低的設計示意圖。

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