打開生物標誌物篩選鑒定的正確方式

黑色素瘤是皮膚最致命的腫瘤，在全球範圍內發病率和死亡率都在上升。黑素瘤的發展經過不連續的階段，具有眾所周知的臨床和組織學特徵，然而，關鍵的潛在分子尚未被明確闡明。故鑒定預後和預測意義的生物標記將有助於更好地了解相關的生物通路。而黑色素瘤後期的黑素含量和儲存的甲醛固定石蠟標本(FFPE)使得基因表達分析比較困難。

加州太平洋醫療中心的John C. Moretto等人的策略是使用兩種基因表達分析技術來驗證晶元數據，在把黑色素瘤和正常皮膚樣本分好類後，一是用QuantiGene Plex Assay直接對組織裂解物進行基因表達定量，二是繼而通過ViewRNA ISH Tissue Assay對FFPE組織切片進行原位雜交分析。

而需要說明的是，這兩種分析方法，都是基於branched-DNA技術，能夠直接、特異性、定量檢測mRNA，無需RNA分離純化，反轉錄和PCR擴增。

Step 1: QuantiGene Plex on 62 genes. Chose the genes with the highest p value.

Step 2: Learned more about the genes with the highest p value.

Step 3: Run QuantiGene View on a subset of the genes.

結果

黑色素瘤相關的62個基因被鑒定分類，利用 QuantiGene Plex多重基因定量，發現7個基因有顯著性差異，繼而進行主要成分分析和聚類分析，發現這些基因跟黑素瘤顯著相關，再利用ViewRNA ISH Tissue Assay對這7個基因進一步原位驗證後，發現其中有4個基因在轉移性黑色素瘤中呈顯著上調。這7個候選基因在表達強度和空間解析度上都呈現很大的不同。這些分子的功能支持血管生成，免疫應答/炎症反應，DNA複製，細胞增殖/能動性，組織侵襲/進程，以及包括表皮發育，細胞通訊和形態發生。

簡單總結一下就是，FFPE樣本，通過晶元篩選出62個基因，首先使用QuantiGene Plex 2.0 Assay鑒定出7個影響顯著的基因。其次使用ViewRNA ISH Tissue Assay進行進一步的原位表達強度和空間解析度的驗證。

從這篇文章中可以看出，QuantiGene Plex 2.0 快速、簡單，準確度、精密度高，通量高, 同時定量檢測幾十個基因。無需RNA提取純化和PCR擴增。而ViewRNA原位雜交分析特異性、靈敏度高，重複性高。

結果顯示出，使用branch DNA 技術驗證黑素瘤生物標記物，在基因表達定量和RNA原位雜交檢測上都是非常強有力的手段！

Branch DNA用於生物標誌物篩選鑒定思路：

發現生物標誌物的首要一步是篩選候選分子，如基於轉錄組晶元或測序可以篩選到重要生理、病理過程關聯的候選基因，其隨後的驗證及擴大的樣本量的繼續驗證是此類研究的必要部分，主要為了通過紮實的證據進一步縮小下游研究的基因數量，進一步減小盲目性。傳統的驗證技術在RNA水平上主要是qPCR。說到Real-time PCR，並不是不好，但是經常會遇到一些問題：首先，要進行核酸提取，核酸抽提過程中不可避免的核酸降解，或者污染，且每個人抽提效果都不一樣，這些因素都會影響你的實驗結果；其次，RT 和PCR 不可避免帶來假陽性。

而採用branched DNA技術，便可克服傳統的real time PCR技術中的缺陷與不確定因素，它無需抽提純化RNA，無需反轉錄，無需PCR擴增，只需用特定裂解液處理樣本，經探針雜交和信號放大即可快速得到精確的定量結果。有些用定量PCR很難分析的血液樣本，或保存多年、mRNA高度降解的FFPE樣本，bDNA同樣具有極高的檢測準確度與重現性。

branched DNA 技術(分支鏈 DNA 信號放大技術，簡稱bDNA) 經過美國FDA認證用於病毒的檢測，通過信號放大技術（而非模板放大），bDNA分析實現了對RNA轉錄本的直接測定！

第三個也是最關鍵的一個是，這兩個技術, branch DNA跟qPCR最主要的一個區別是什麼呢？是branch DNA帶來的數據的質量！當你的CV較好的時候，你可以在更少的樣本中達到更高的重現性。

基於Branch DNA信號放大技術的多重基因定量QuantiGenePlex（簡稱QGP），能單孔同時定量多達80種RNA，節省大量時間，兩天內就可以完成近200份樣本中80 種基因的定量！大大提高了檢測通量與效率！

Branch DNA（QuantiGene）用於基因定量的優勢

1．對任何樣本都不需要做核酸抽提：消除了抽提過程中干擾的因素。避免核酸降解，樣本損失。且減少工作量。

2．不需要做反轉錄和PCR，避免一些假陽性。

3．數據質量高：線性相關的信號結果使數據質量更精確，且數據處理更加簡單

4．特異性高：每個基因設計多個探針，高度的探針覆蓋率增強了檢測的特異性

5．通量高，靈活性：一個孔可以做多達80重基因，真正意義上的高通量

6．操作簡單：類似核酸的ELISA，重複性更高。

7．實驗快速：一天半時間可獲得7680（96*80）數據點。

8．可分析任何樣品，任何靶標，輕鬆搞定RNA抽提困難戶（如血液、保存已久的FFPE等）

前期篩選的靶標要想成為真正的生物標誌物應用於臨床診斷等，必須經過原位的驗證。RNA 原位雜交除了是對傳統蛋白水平上的IHC和DNA 水平上的DNA FISH的補充，又有其獨特的優勢：比如不像病毒、特殊物種的IHC受抗體的限制，且時下熱門的lncRNA、miRNA、cirRNA由於不表達蛋白，故RNA水平的檢測無疑是絕佳的選擇。

傳統的原位雜交技術局限於靈敏度、特異性不高，而大部分RNA拷貝數在細胞中都很少，而且像一些癌症病人來源的組織穿刺樣本,樣本本身量就特別少，所以高靈敏度的原位雜交技術就顯得尤其重要。So，基於b-DNA信號放大技術的單細胞單拷貝級別靈敏度的ViewRNA原位雜交技術無疑開啟了細胞內定位RNA分子的新時代！其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標RNA。

Branch DNA（ViewRNA）用於RNA原位雜交的優勢：

1.應用廣泛：針對任意RNA靶標的簡單雜交分析，無放射性，無需抗體；

2.高特異性：基於專利的探針組設計和branched DNA (bDNA)信號放大技術；

3.極高靈敏度：單細胞水平實現單拷貝級別靈敏度；

4.兼容降解的RNA樣本；

5.無需RNase-free操作和環境要求，一天即可完成實驗；

6.多重靶標共標定位；

7.實現RNA與蛋白共定位；

8.檢測結果穩定一致性，兼容高通量自動化平台。

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