CRISPR/Cas技術最新進展：保持DNA完整而又激活靶基因

基因編輯技術CRISPR/Cas

基因編輯技術CRISPR/Cas系統因其操作簡便、能高效精準的在特定位點對DNA進行切割和編輯，近年來一直是生物技術領域的研究熱點。CRISPR/Cas是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防禦機制，用來對抗病毒和外源DNA的入侵。其中Cas (CRISPR associated protein)是一種核酸內切酶，在含有與靶標DNA互補序列的嚮導RNA的指引下識別DNA的特定位點並進行切割，形成雙鏈DNA缺口，隨後細胞藉助同源重組或者非同源末端連接機制對斷裂的DNA進行修復，從而形成DNA插入或移除的突變，實現基因編輯。

RNA介導的CRISPR/Cas9系統定向基因組修飾作用機制示意圖

雖然基於CRISPR的基因編輯系統，在許多人類疾病的小鼠模型中顯示了極大的治療潛力，但Cas9在誘導DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks，DSBs)的過程中可能脫靶，引入未知的突變，對病人造成傷害，限制了其臨床應用。

改進的CRISPR/Cas9技術

《Nature Reviews Genetics》高級編輯Darren J. Burgess近期撰文「Translational genetics: CRISPR therapies - making the grade not the cut」，點評了美國Salk生物研究所Juan Carlos IzpisuaBelmonte課題組研究人員利用改進的CRISPR/Cas9技術介導轉錄-表觀遺傳調控，在小鼠體內激活多個靶基因的工作。

Juan Carlos Izpisua Belmonte課題組改進的CRISPR/Cas9系統圖示

利用CRISPR系統對轉錄進行調控，通常需要將不具有核酸酶剪切功能的Cas9 (dCas9)與能調節轉錄的蛋白區域進行融合，該蛋白區域可以是轉錄激活因子、轉錄抑制因子或是組蛋白修飾酶。隨後該融合蛋白被設計好的單導向RNA (single-guide RNA, sgRNA)引導到靶基因的位置。由於最適合基因治療的載體是腺相關病毒 (AAV)，但腺相關病毒的負載容量有限，無法承載典型dCas9融合蛋白的編碼基因。為了克服dCas9/sgRNA和協同轉錄激活複合物的編碼序列超出了通用AAV容量的技術難題，Juan Carlos Izpisua Belmonte課題組研究人員對CRISPR/Cas9系統進行了改進。

單導向RNA(sgRNA)的改進

首先他們改進sgRNA，引入MS2迴路，使其不需要與Cas9融合，就能以獨立方式募集轉錄激活蛋白MS2–P65–HSF1 (MPH)；其次，他們縮短了sgRNA的序列長度(用14或15個鹼基對代替20個鹼基對)，使其即使與野生型Cas9結合形成複合物，該複合物也不會對靶基因進行切割(研究人員把這些sgRNA稱作dgRNAs)。利用上述改進，研究者可以方便的把基於CRISPR的轉錄激活組分編碼進2個AAV：一個編碼dgRNA和轉錄激活蛋白MPH，另一個編碼Cas9，讓sgRNA結合轉錄激活蛋白MPH輔助Cas9工作。

CRISPR/Cas9技術改進後的效果

隨後，研究小組在多個小鼠疾病模型中測試了這一系統是否能減輕疾病癥狀。在大多數實例中，他們首先利用細胞培養來確定能夠有效激活靶基因的dgRNAs，隨後用一個AAV載體將dgRNA和MPH一同輸入到表達野生型Cas9的轉基因小鼠體內(或是通過血液注射或是局部注射進相應的器官)。通過實驗，他們證明了上調白介素(Il10)或klotho (Kl)基因表達能夠減輕順鉑誘導的腎損傷；上調肝臟中的胰十二指腸同源異型盒基因1 (pancreatic andduodenal homeobox gene 1，Pdx1) 能誘導肝細胞向分泌胰島素的細胞轉分化並部分緩解鏈脲黴素誘導的高血糖 (小鼠I型糖尿病模型); 上調utrophin (Utrn)基因，無論在新生期還是疾病發生後，在杜氏肌營養不良(由肌萎縮蛋白基因功能失調引起)mdx基因模型中都能緩解肌無力。

這一研究中，能夠過度表達像utrophin這樣的大基因是引人注目的, 因為cDNA的大小超出了大多數載體的裝載能力, 通過標準的基因治療方法很難實現。在表達Cas9的小鼠體內證明了上調卵泡抑制素(Fst) 能增加肌肉質量後，作者又證明了同時向肌肉注射編碼dgFst–MPH和Cas9的AAV或編碼dgUtrn–MPH和Cas9的AAV，在不表達Cas9的mdx小鼠模型中也能緩解肌無力癥狀。

Cas9變體：野生型Cas9 or dCas9

弄明白野生型Cas9和dCas9(即不具有核酸酶剪切功能的Cas9)，哪一個是更合適的Cas9變體，將是非常有趣的。Juan Carlos Izpisua Belmonte課題組的研究顯示，在同一個實驗中，野生型的Cas9和dCas9對Fst具有相同的轉錄激活作用。雖然利用Surveyor測試和深度測序，他們沒有檢測到野生型Cas9誘導的DNA雙鏈斷裂，但dCas9在不引起DNA雙鏈斷裂方面有雙重保險，如果dCas9能在更多的實驗中被證明具有和野生型Cas9相當的轉錄作用，那麼將來dCas9可能會是更好的變體。

改進後的CRISPR/Cas9系統在小鼠糖尿病、肌肉萎縮症和急性腎病等模型中均顯示出了治療效果。儘管我們對其療效能否長期保持還存在一些疑問：例如，一次注射後轉錄調節能持續多久，多次注射後作用效果是否會因為機體對AAV的免疫反應或AAV的荷載問題而逐漸減弱，但這一系統為將來更好的用於治療人類疾病奠定了良好的基礎。

小結：Juan Carlos IzpisuaBelmonte課題組的研究工作闡述了應用CRISPR/Cas9激活體內基因治療疾病的概念。在不產生DNA雙鏈斷裂，保持DNA完整性的同時成功激活了靶基因，調節了生理相關表型，避免了基於CRISPR/Cas9的常規基因編輯技術在用於人類疾病治療時存在的突變隱患。正如GeorgeM. Church所說的，CRISPR這一革命性技術的下一站將是RNA引導的表觀遺傳調節。

參考文獻：

1.Darren J. Burgess. CRISPR Therapies — Making the Grade Not the Cut. Nature Reviews Genetics. 2017, 12December

2.Hsin-Kai Liao, Fumiyuki Hatanaka, Toshikazu Araoka et al. In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell, 2017,171, 1495–1507. ?

3.Biotechnology: Rewritinga genome

4.In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation. Cell, 2017,171, 1495–1507

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