一種改良的CRISPR/Cas9基因編輯方法

CRISPR/Cas9基因編輯系統在基因治療方面具有巨大潛力，可被用於校正致病性基因突變。Cas9蛋白在gRNA的引導下對靶基因進行切割，產生雙鏈切口（DSB）。但是基因組DNA經Cas9切割後修復的過程中常常會帶來意外的突變，這一缺陷會是限制其在臨床領域大展拳腳的重要原因之一。2017年12月22日發表在《Genome Research》雜誌上的一篇名為《Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair》文章中，研究者將CRISPR/Cas9技術進行了改進，改進之後的系統在保證基因編輯效率的情況下，能夠顯著降低編輯錯誤，減少意外突變。

研究背景

DSB通過同源定向修復（HDR）或非同源鏈末端連接（NHEJ）的方式進行修復。HDR是是以姐妹染色單體或外源供體DNA為模板進行修復。但是由於HDR不是人的體細胞修復DNA損傷的主要修復途徑，所以外源DNA插入DSB位點的效率很低。細胞修復DSB的主要方式是NHEJ，該途徑會產生indel突變。

本文作者制訂了一個精確而有效的基因校正策略。研究者通過在供體質粒和靶向基因上各自引入一個nick，在保證準確基因編輯的同時，大大降低了可能導致基因組不穩定的因素。

實驗思路

1、在mCherry-P2A-EGFP報告細胞系（EGFP含無義突變）中探討靶向EGFP同一條鏈的雙sgRNA引起的TN（Tandom Nick）是否能夠促進有效的基因編輯。

2、探討當供體質粒骨架上存在SN（Single Nick）時是否促進靶向基因組EGFP的單個sgRNA產生的SN引起的的基因編輯。

3、對比SNGD(SNs in the target gene and donor plasmid)與Cas9誘導的DSB介導的基因編輯效率。

4、探討修復模板的長度對SNGD介導的基因編輯的影響及修復模板中整合進基因組的DNA序列範圍。

5、探討與HDR相關的因子是否參與了SN介導的基因編輯過程。

6、應用實例：用SNGD介導的基因編輯校正TSCERS細胞中發生1bp插入突變的內源基因TK1。

實驗結果

1、基因組 DNA上的TN（Tandom nick）可誘導有效的基因編輯。（A）將帶有c.321C>G:

p.Y107? EGFP 突變的mCherry-P2A-EGFP 報告基因整合到293T細胞的基因組。由於EGFP發生了無義突變，細胞不表達EGFP，但表達mCherry。當含有EGFP修復序列（4-720bp）的donor DNA把c.321C還原成G時，EGFP表達。（B）設計3條靶向EGFP正義鏈的sgRNA。（C）構建一系列修復模板供體質粒。（D）基因組DNA上產生TN時，細胞恢復表達EGFP。當供體質粒也被切割產生nick時，TN的引起的編輯效率與兩個sgRNA靶向位置的距離遠近無關。

2、基因組和供體質粒上的SN（Single nick）可以促進有效的核苷酸替代。（A）設計7條靶向供體質粒pUC57骨架的sgRNA。（B）7條sgUC57s分別與sgEGFP332s共轉，均能引起EGFPcC>G reporter中核苷酸的有效替換。且SNGD的鹼基替換效率。（C）供體質粒中的SN無論在哪條鏈上都可以促進SNGD介導的基因編輯。（D）將靶向EGFcC>G reporter的sgRNA在供體質粒上對應的PAM進行突變後，SNGD引起了14.2%的鹼基替換。DSB對應的鹼基替換效率比SNGD低了2%。

3、SNGD比Cas9誘導DSB介導的報告基因編輯更精確。（A）構建報告細胞系：同時整合了 mCherry-P2A-EGFP c.321C>G 和tagBFP-P2A-EGFP c.321C>G 。在每個報告基因sgRNA靶向的位置引入nick或DSB。將帶有nick質粒且PAM被無義突變的供體質粒和靶向報告基因的sgRNA共轉染進細胞。篩選EGFP陽性的單克隆細胞並進行DNA序列分析。（B）在EGFP陽性的單克隆細胞中，WT-Cas9引起的indels高達92.3%，而SNGD引起的indels卻只有3.57%。SNGD對應的編輯效率為14.3%，而DSB對應的效率為5.77%。（C和D）經過三次的重複轉染，SNGD使得EGFP細胞的陽性率高達34%，第四次轉染後可高達41%。（E）經過三次的重複轉染後，篩選EGFP陽性單克隆細胞，進行序列分析，正確編輯效率高達37.5%。

4、SNGD介導的基因編輯中靶基因整合修復模板的長DNA序列。（A）不同長度的修復模板示意圖。（B和C）不同修復模板的鹼基替換效率。（D）在修復模板中引入4或17個鹼基的突變。（E）降低EGFPcC>G reporter和供體序列間的同源性會抑制SNGD介導的基因編輯。

5、非典型HDR促進SNGD介導的基因編輯。（A和B）在報告細胞株中Knockdown CtIP、BRCA2或 RAD51，會抑制DSB誘導的鹼基替換。（C）Knockdown BRCA2或 RAD51 顯著抑制SN介導的鹼基替換。（D）Knockdown CtIP不會抑制SN介導的鹼基替換。（E）Knockdown CtIP對SNGD介導的鹼基替換無影響。（F）Knockdown RAD51 促進SNGD介導的鹼基替換。（G）Knockdown RAD52 不會抑制SNGD介導的鹼基替換。

6、通過SNGD介導的基因編輯可精確地校正胸苷激酶1基因（TK1）。（A）設計靶向TK1且包含TK1 exon4 1-bp insertion的sgRNA。（B）帶有TK1突變的TSCER2細胞對CHAT培養基敏感。將sgRNA與 Cas9D10A/Cas9-P2A-GFP共轉TSCER2細胞，篩選GFP陽性的單克隆細胞，用CHAT培養基進行培養擴增。經過DSB和SNGD介導的基因編輯處理，對CHAT培養基產生抗性細胞百分比分別為45%和9.6%。（C）經測序分析，在SNGD介導產生的對CHAT培養基敏感的單克隆細胞株中，TK1序列被正確校正的比例為92/92，而DSB對應的比例為18/92。

研究意義

該方法可以糾正任何核苷酸的轉換。精準Cas9系統可能以一種更有效、精準的方式治療一系列疾病。SNGD介導的精準基因編輯將使得基因修復過程更加的安全。

原文摘要

CRISPR/Cas9, which generates DNA double-strand breaks (DSBs) at target loci, is a powerful tool for editing genomes when codelivered with a donor DNA template. However, DSBs, which are the most deleterious type of DNA damage, often result in unintended nucleotide insertions/deletions (indels) via mutagenic nonhomologous end joining. We developed a strategy for precise gene editing that does not generate DSBs. We show that a combination of single nicks in the target gene and donor plasmid (SNGD) using Cas9D10A nickase promotes efficient nucleotide substitution by gene editing. Nicking the target gene alone did not facilitate efficient gene editing. However, an additional nick in the donor plasmid backbone markedly improved the gene-editing efficiency. SNGD-mediated gene editing led to a markedly lower indel frequency than that by the DSB-mediated approach. We also show that SNGD promotes gene editing at endogenous loci in human cells. Mechanistically, SNGD-mediated gene editing requires long-sequence homology between the target gene and repair template, but does not require CtIP, RAD51, or RAD52. Thus, it is considered that noncanonical homology-directed repair regulates the SNGD-mediated gene editing. In summary, SNGD promotes precise and efficient gene editing and may be a promising strategy for the development of a novel gene therapy approach.

Nakajima K, Zhou Y, Tomita A, et al. Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair.[J]. Genome Research, 2017.

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