克隆一條給人治病的「狗」

2005年，世界首例體細胞克隆狗在韓國誕生。近年來，隨著 CRISPR/Cas9 技術興起，基因編輯效率的大幅度提高，狗的基因編輯與基因編輯克隆也相繼獲得成功。

世界首例基因敲除犬

2014年6月底，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院的賴良學研究員團隊聯合南京大學、廣州醫藥研究總院有限公司等單位，利用 CRISPR/Cas9 技術率先在犬基因組中實現基因敲除，成功構建出世界首例基因（Myostatin，MSTN）敲除狗「大力神」與「天狗」，也就是敲除了狗的肌肉生長抑制素基因，讓其比普通犬更加肌肉發達。四個月時，「大力神」與「天狗」就表現出超強的運動能力，且「天狗」還具有明顯「雙肌」性狀。

MSTN 基因敲除犬「大力神」與「天狗」

2016年，賴良學團隊與北京希諾谷生物科技有限公司合作，繼續犬的基因編輯研究。此次研究的是一個與心血管疾病相關的基因 APOE（apolipoprotein E），用於構建心血管疾病動物模型。

2016年12月29日，世界首例動脈粥樣硬化疾病模型犬「蘋果」誕生。20天後，另一隻 APOE 基因敲除犬「葫蘆」誕生。兩隻 APOE 基因敲除犬都表現出血脂、膽固醇升高的癥狀。這是我國首次將其應用於人類遺傳疾病犬模型的培育，標誌著我國基因編輯犬技術已走向成熟。

世界首例基因敲除克隆犬

世界首例動脈粥樣硬化疾病模型犬「蘋果」誕生後，科研人員就展開了對「蘋果」體細胞克隆的研究。2017年，賴良學研究員團隊克隆出「蘋果」的「翻版」——「龍龍」。這是中國首例完全自主培育的體細胞克隆犬，更是世界首例基因編輯克隆犬。

這標誌著我國成為繼韓國之後，第二個獨立掌握犬體細胞克隆技術的國家，填補了我國體細胞克隆犬的技術空白，並達到國際領先水平。

基因敲除克隆犬「龍龍」、「希希」、「諾諾」

基因編輯和克隆技術的結合

基因敲除犬，基因敲除克隆犬，傻傻分不清。先認識一下基因編輯與克隆技術。

基因編輯技術是一把神奇的「剪刀」，它是指對目標基因進行「編輯」，實現對特定 DNA 片段的敲除、敲入等。CRISPR/Cas9 技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進後，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地「編輯」任何基因。

而克隆技術，是指生物體通過體細胞進行無性繁殖的技術。克隆羊「多莉」是第一例運用這種技術培育出來的動物，隨後，克隆豬、牛等紛紛問世，克隆犬直至2005年才問世。基因編輯與克隆技術相結合，具有廣泛的運用前景，在品種改良、疾病研究、生物醫藥等方面都具有巨大的價值。

上文說到的基因敲除犬，就是指在受精卵時期注射基因編輯「剪刀」 CRISPR/Cas9 ，從而獲得特定基因修飾的犬；而基因敲除克隆犬，採用的是「基因編輯+克隆」技術，是指首先獲得基因修飾的細胞，然後再用特定基因修飾的細胞進行克隆，這樣可以獲得基因修飾完全一致的克隆犬。

其實通俗來說，基因敲除犬是說人們對狗狗敲入或敲除某個基因，對它「功能定製」；然後以其為模本進行複製或「批量」生產，即克隆，這個就是基因敲除克隆犬。

犬基因編輯與克隆為何如此困難

犬被科學界普遍認為是最難克隆的動物之一，而克隆犬的首要難題是成熟卵母細胞的獲取。

犬體內獲取的成熟卵母細胞

用於犬體細胞克隆的成熟卵母細胞，需要採用體內成熟方法，獲取體內成熟卵子。狗的發情周期長，但排卵後從卵母細胞成熟到老化的間隔時間卻很短。因此，獲取成熟且質量好的卵母細胞窗口期非常非常的短。這就要求科研人員準確判斷狗的排卵及卵子成熟的時間，才能獲得處於理想狀態的卵子用於克隆胚胎的製備。

一旦錯過卵子成熟的時間，下次排卵，就要等半年甚至一年。一隻狗每個發情周期平均排卵7-8枚，手術取卵時間過早，卵子沒有成熟；取卵子時間過晚，卵子又老化；甚至同一隻狗也會出現衝出的卵子有的成熟，有的未成熟。因此，犬基因編輯與體細胞克隆尤其困難。

儘管困難重重，但賴良學研究員團隊近年來還是取得了斐然的成果，而科研人員還在努力鑽研，爭取提高狗的基因編輯克隆效率，構建出更多具有相同遺傳背景的克隆狗，用於基礎科學、疾病研究、生物醫藥等方面的研究。

來源：中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院

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