lncRNA實戰項目-第五步-差異表達的mRNA和lncRNA

最新 02-18

響應生信技能樹的號召：lncRNA數據分析傳送門, 一起來一個lncRNA數據分析實戰！

很明顯，得到了表達矩陣之後，根據上面的樣本信息，可以按照年齡，性別，取樣部位來進行分組找差異。

可以參考：https://github.com/jmzeng1314/my-R/tree/master/DEG_scripts

上一步驟得到了表達矩陣，兩個樣本分別是F_1yr.OC和M_1yr.OC, 所以接下來的差異分析就是比較1歲獼猴腦OC區域女性和男性的差別，差異分析的分析方法很多，主要根據前面標準化的方法，有基於counts的差異分析，也有基於標準化後的FPKM，TPM等的差異分析。

常見的R包有（摘自https://github.com/jmzeng1314/my-R/tree/master/DEG_scripts）：

edgeR (Robinson et al., 2010)

DESeq / qDESeq2 (Anders and Huber, 2010, 2014)

DEXSeq (Anders et al., 2012)

limmaVoom

Cuffdiff / Cuffdiff2 (Trapnell et al., 2013)

PoissonSeq

baySeq

作業里給的參考是一步法差異分析，是對常見的R包做了下封裝，包括了對轉錄組的raw counts數據分析DEseq2包和edgeR包，及對於晶元等normalization好的表達矩陣數據的limma和t.test等。用的時候只要設置好表達矩陣和分組矩陣，然後選擇特定的方法，一步就可以進行差異分析。

但是這裡的樣本是無生物學重複的，無重複的數據做差異分析是一件很麻煩的事，可靠性都不能保證。。。但是目前由於測序的價格，還有樣本自身的珍貴稀缺性，部分實驗設計仍然是沒有生物學重複的。對於無重複樣本的差異分析有幾種方法可以選擇，如edgeR，DEGseq和GFOLD等。下面分別嘗試edgeR，DEGseq及GFOLD：

edgeR做無重複樣本的差異分析

edgeR針對無重複樣本給出了四條建議，第一條建議是僅分析MDS plot和fold changes，不做顯著性分析；第二條建議是設置合適的離散度值，然後做個exactTest 或glmFit；第三條看不懂；第四條建議是基於大量的穩定的參照轉錄本。

edgeR

DEGseq對無重複樣本差異分析

也有推薦DEGSeq 中MARS方法的（MARS: MA-plot-based method with Random Sampling model）。

MA.plot

GFOLD對無重複樣本進行差異分析

該軟體稱尤其適合做無重複樣本的差異分析，他對foldchange 的計算考慮到posterior distribution，即克服了pvalue評估顯著性的缺點，同時也克服了 fold change 在評估低counts 數的gene時的缺點。

下載軟體：

安裝GFOLD時，需要先安裝gsl,然後再編譯安裝gfold。

該軟體的功能包括5部分：

1）Count reads and rank genes；

2）Count reads；

3）Identify differentially expressed genes without replicates;

4)Identify differentially expressed genes with replicates;

5)Identify differentially expressed genes with replicates only in one condition.

下面是無重複樣本計算差異的例子：

對於前面得到的counts列表（hisat_matrix.out）每個樣本單獨分開，並命名為samplename.read_cnt(一定要加後綴.read_cnt).

這裡查看下F.OC.read_cnt是否有頭文件，若有最好注釋掉，否則後面差異結果有錯位。然後用gfold diff 一步就可以求出差異基因。輸出文件包含4列，第一列GeneID, 第二列是gfold值，gfold值的正負對應著基因的上調和下調，gfold=0認為是無差異的，E-FDR對無重複樣本總是1，第四列是log2fold change。

上調基因：4324，下調基因：4240，差異變化閾值設置gfold為1時，上調的基因有83個，下調有97個。

差異基因初步統計

用edgeR共篩選到1322個差異顯著基因（篩選條件：PValue1）; 用DEGseq共篩選到743個差異顯著基因（篩選條件：abs(log2(Fold_change) normalized ) >1 & p-value < 0.05 & q-value(Storey et al. 2003) 1 && gfold