New Phytologist：大麥條紋花葉病毒感染需要PKA介導的γb磷酸化抑制RNA沉默和宿主細胞死亡

今天為大家帶來一篇比較經典的文章，是中國農大Li Dawei等今天發表在《新植物學家》上題為《Barley stripe mosaic virusinfection requires PKA-mediated phosphorylation of γb for suppression of both RNA silencing and the host cell death response》的研究論文。

大麥條紋花葉病毒 (BSMV) γb 蛋白是一種病毒抑制 RNA 沉默 (VSR) 和癥狀決定因子。然而, 在翻譯後的修飾如何影響γb 的不同功能方面尚不清楚。

在這裡，作者表明，在體內和體外，PKA 樣激酶介導了γb 在 Ser-96的磷酸化。 病毒突變體非磷酸化(BSMVS96A 或 BSMVS96R) 在本生煙草中的病毒積累減少，是因為瞬時誘導了細胞死亡反應而將病毒限制在壞死區。相比之下，模仿γb磷酸化的BSMVS96D 突變體病毒與野生型病毒的表型相似。

此外，S96A 突變體減少了局部和系統性的γb VSR活性，因為它破壞了其結合 21-bp dsRNA的能力。然而，其他 VSRs 的過度表達未能挽救 BSMVS96A 誘發的壞死，表明γb 磷酸化抑制細胞死亡在功能上有別於其 RNA 沉默抑制活性。

這些結果為γb磷酸化在調節RNA沉默和BSMV誘導宿主細胞死亡反應方面的作用提供了新的見解，並有助於我們了解在病毒感染期間，病毒如何在宿主體內優化病毒複製和病毒生存之間的平衡。

黑暗大邪神點評：讓我們仔細地研讀一下文章。

第一，BSMV的γb蛋白在寄主內磷酸化

因為γb是一個多功能的蛋白，不但是VSR，也是癥狀決定因子，而它的翻譯後水平的修飾又不是很清楚。作者就在煙草中表達了γb，用磷酸化抗體去雜，能夠雜出目的條帶。（這一步可能是預實驗，有了這個結果才能向後推進）。

隨後要分析可能的磷酸化位點，作者提取了總蛋白，用GC-MS做進一步的結構方面的分析（具體的我不是非常清楚原理），得到了18個磷酸化位點，其中5個是高分位點：Y89，S96，S136，S137，S141。然後用突變實驗，將這幾個位點去磷酸化，顯示S96位去磷酸化後，病毒積累量建設，病毒癥狀減輕。

這是一個宏觀的結論，也是一個有生物學的表型的差異，有了這個才能後後續的實驗設計。

第二，PKA樣激酶參與了γb的S96的磷酸化

就是要證明，誰幫助了γb的磷酸化。最後認為，是PKA樣激酶。

從大腸桿菌中純化重組γb-6xHis 蛋白, 並將煙草可溶性蛋白提取物作為激酶來源進行體外磷酸化試驗。基於對蛋白質的磷酸化特異性分析以及來自在線伺服器 KinasePhos (http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw) 和 NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) 的預測，認為PKA樣激酶參與了γb的磷酸化，最後也確認了這一個結果。

這兩個網站大家可以記一下~

第三，磷酸化抑制 BSMV 引起的細胞死亡並促進煙草的感病性

這一步，就是說明問題的地方，這個磷酸化有什麼用？？

γb的磷酸化抑制早期細胞死亡對 BSMV感染的反應，這很可能是由 SA 介導的植物防禦機制引起的。此外, γb似乎是在相對較晚的階段，促進 BSMV 的致病性。

這裡的方法都是比較經典，主要是看這個結論，

第四，γb磷酸化抑制單子葉植物 BSMV 引起的漂白表型並促進病毒積累

這一步，是回到BSMV的自然寄主，檢測在自然寄主上，是不是有相同的生物學差異，一看果然有。回到了自然寄主上，更能順理成章了。做的工作也是檢測病毒積累量、觀察寄主的癥狀者兩個方面。

第五，Ser-96 中γb的磷酸化是其 VSR 活性所必需的。

既然提到γb是一個VSR，那就要看看磷酸化和沉默抑制的關係了。設置不同的對照，說明幾個結論：

1）Ser-96 中γb的磷酸化需要有效的 VSR 活性。

2）Ser-96 的 γb磷酸化需要抑制局部 RNA 沉默以及沉默信號的系統運動。

3）PKA 介導的磷酸化增強γb的結合21-bp dsRNA的能力，促進其VSR活性。

這其實包含兩個方面的意思，1和2說明了沉默抑制對於磷酸化的作用，3說明了磷酸化對於促進沉默抑制活性的作用。

第六，BSMV 抑制的細胞死亡反應在功能上與 VSR 活動不同

既然磷酸化和沉默抑制活性有緊密的聯繫，那其他沉默抑制子對它有沒有貢獻呢？作者換了其他的沉默抑制子P19 HC-Pro P38 2b等，進行了探究。

結果顯示，其他 VSRs瞬時表達或 BSMV 基因組的過度表達, 都不能抑制BSMVS96A 誘導的細胞死亡反應，說明磷酸化抑制細胞死亡反應不是由於其 RNA 沉默抑制活性。

第七，S96A 突變減少病毒複製, 但不影響γb自生互作

其實，第六第七個結論，我在說明的時候，換了一下，趕緊邏輯上似乎更通一點（個人觀點）。

這個結論說明的現象也是十分有意思，就是γb的自生互作，並不受磷酸化的影響，但是BSMV整個病毒的複製，受到了磷酸化的影響，說明了S96磷酸化，是和其他因子產生作用（有可能是VSR），作為一個病毒複製（replication）-病毒生存（survival）平衡之間的協調者。

整體的文章通讀了一遍，就是這樣，我個人有幾點啟發：

第一，針對了一個多功能蛋白（癥狀決定因子和沉默抑制子），它的翻譯後修飾（磷酸化），整體的故事很有意思，既有一條鏈式的主線，也有延伸和觸類旁通，證據鏈較為完整，這方面涉及的也比較少，具有創新性。

第二，磷酸化、病毒複製、沉默抑制活性、抑制寄主誘導的細胞死亡，四者之間的關係，就目前的結論，能不能有一個示意圖？

第三，關於實驗的設計，比較經典。例如自身互作驗證、VSR結合小RNA活性測試、磷酸化位點的預測與驗證，我們可以借鑒和學習。

今天就策到這裡~

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！