C＆EN深度：蛋白靶向降解技術正在重定義小分子藥物

▎葯明康德/報道

蛋白靶向降解 (targeted protein degradation) 是藥物研發領域的一個新興方向。自從人類基因組被解讀以來，研究人員就在試圖靶向成千上萬導致疾病的蛋白。但是他們發現傳統的小分子和抗體藥物只能靶向大約20%的蛋白。這一局限性給了基於RNA的藥物和基因編輯技術很大的發展空間，因為它們有可能靶向另外80%的蛋白。但是這些新技術也需要面對一系列挑戰，其中包括藥物遞送問題，藥效和安全性問題。蛋白靶向降解藥物力圖將小分子設計成為一種新型藥物，傳統小分子的作用是阻斷蛋白的功能，而蛋白靶向降解劑的作用是通過將這些蛋白送入蛋白酶體 (proteasome) 將它們完全降解。近日《C&EN》雜誌專門撰文對這種新興藥物的巨大前景進行了盤點。

蛋白靶向降解藥物機理

我們的細胞一直在努力維持適當的蛋白水平，每一刻它們都在生成和降解成千上萬種蛋白。維持蛋白平衡的關鍵因子是一個稱為泛素 (ubiquitin) 的小蛋白。當它被鏈接到蛋白上後，它會導致這些蛋白被運送到蛋白酶體中進行降解。

▲泛素蛋白的圖示（圖片來源：By Rogerdodd (Own work) [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons）

開發蛋白降解藥物的研究人員希望能夠利用泛素-蛋白酶體的降解機制來改變導致疾病的蛋白的命運。為了達成這個目標，他們設計出一種具有兩個活性端的小分子，一個活性端可以與靶向的蛋白相結合，而另一個活性端可以與稱為E3泛素連接酶 (E3 ubiquitin ligase) 的蛋白相結合。這種雙功能小分子能夠強迫泛素與靶向蛋白相結合，將它們運送到細胞的垃圾處理站中。在蛋白被降解後它們可以繼續靶向其它蛋白，從而迅速降低不需要的蛋白的水平。

▲蛋白髮生降解的過程（圖片來源：Kymera Therapeutics）

與傳統藥物不同，這些小分子的行為更像酶或者催化劑，一個小分子可以重複將多個靶向蛋白送入垃圾處理站。因此，它們不符合傳統的藥物效力和特異性的標準。最初，這些蛋白靶向降解分子只是學術研究領域中的新奇事物，但是隨著一系列學術論文表明在細胞中靶向降解是消除錯誤蛋白的有力手段，生物醫藥產業開始對這項技術產生濃厚的興趣。自2016年以來，多家專註於蛋白降解的生物技術公司出現並且獲得大筆資金。同時大型醫藥公司開始啟動內部研發並且達成各種合作協議來探索這種新的成藥方式。下面我們來回顧一下蛋白降解從學術領域的新奇事物轉變為熱門領域的歷程。

從新奇事物到熱門領域

雖然風投和大型醫藥公司對蛋白靶向降解有著大量關注，但是這個概念並不新穎。在上世紀90年代末就有一家名為Proteonix 的生物技術公司遞交了關於使用雙功能分子利用細胞泛素系統的專利。與此同時，耶魯大學 (Yale University) 的化學生物學家Craig Crews博士和加州理工大學 (California Institute of Technology) 的細胞生物學家 Raymond Deshaies博士也發表學術論文表明類似多肽的小分子可以導致蛋白降解。但是這些化合物沒有能夠成藥的特性，因此並沒有得到生物醫藥產業的重視。

▲耶魯大學的化學生物學家Craig Crews博士（圖片來源：耶魯大學）

在2008年，Crews博士組建了一支由化學家和生物物理學家構成的團隊來進一步推動這方面的研究，他們的目標是開發出第一個具備催化特徵的小分子藥物，他稱之為「PROTACs」，代表蛋白降解靶向嵌合物 (proteolysis-targeting chimeras)。

Crews的研究團隊面對的一個關鍵性挑戰是找出一個能夠與E3連接酶結合的活性端，它使將泛素載入到蛋白上成為可能。但是利用E3連接酶通常意味著擾亂一個多蛋白複合體，這是一個歷史悠久的難題。

▲PROTAC技術的圖示（圖片來源：耶魯大學）

在2015年，兩組發現激發了現在業界對蛋白降解的狂熱追逐。當時在丹娜·法伯癌症研究所 (Dana-Farber Cancer Institute) 工作的Jay Bradner博士率領的化學生物學團隊在《科學》雜誌上發布了一種能夠與名為cereblon的新E3連接酶結合的創新小分子降解劑 (Science 2015, DOI: 10.1126/science.aab1433)。同時， Crews博士的團隊也發布了他們自己開發的小分子降解劑 (ACS Chem. Biol. 2015, DOI: 10.1021/acschembio.5b00442)。

投資者開始關注這一領域。「這一領域技術的日漸成熟和能夠利用這一技術探索人類蛋白組中剩下的85%的可能性是令人無法抗拒的組合，」Kymera Therapeutics公司的創始人兼首席技術官Nello Mainolfi先生說。該公司是Altas Ventures在2015年開始幫助建立的專註於蛋白降解的生物技術公司。

Crews博士在兩年前已經創建了Arvinas公司來進行PROTACs的商業化。在2016年，Bradner博士和其它學術研究人員創建了C4公司並獲得7300萬融資。這兩家公司迅速與默沙東 (Merck)，輝瑞 (Pfizer) 和羅氏 (Roche) 等大型醫藥公司達成合作關係。

同時，包括諾華 (Novartis) 和阿斯利康 (AstraZeneca) 在內的其它大型醫藥公司開始對蛋白靶向降解進行投入。Bradner博士在2016年加入諾華並且領導該公司包括200多名化學家、生物學家和計算機科學家構成的蛋白降解研發組。

重新定義小分子藥物

隨著更多的公司湧入這一領域，他們需要重新思考小分子藥物的設計。構建一個蛋白降解劑需要慎重考慮組成它的每個部件：包括與蛋白結合的配體，與E3連接酶結合的活性端，和連接兩者的化學鏈。

完全組裝起來後，這些分子違反了很多藥物化學領域最神聖的信條，其中最著名的是藥物化學家Christopher A. Lipinski博士提出的五規則。這是預測一個分子能否成為好的口服藥物的一系列指標。按照這些規則，蛋白降解劑分子量過大，而且有太多氫鍵供體和受體。

▲一些潛在的蛋白降解藥物（圖片來源：《C&EN》）

蛋白降解劑不但看起來不會是好藥物，而且在藥物的結合能力，特異性和劑量等概念上與傳統觀念也出現了偏離。通常藥物化學家們希望設計出一個分子，特異性地與靶點牢牢地結合在一起。他們的思維方式是最大化藥物與蛋白結合的時間。

但是對蛋白降解劑功能的衡量標準不是它們與蛋白的結合有多緊密，而是雙功能分子能夠以多快的速度將各個蛋白連接起來，讓靶向蛋白能夠被泛素標記並且運送到蛋白酶體中。這一從結合熱動力學 (binding thermodynamics) 向反應動力學 (reaction kinetics) 的轉變是讓人們對蛋白降解劑靶向以前無法成藥的靶點寄予厚望的原因。

這些分子的末端不需要結合到關閉蛋白功能的蛋白域，它們只需要與靶點結合足夠長的時間完成泛素標記的過程。雖然75%的蛋白缺少讓傳統小分子抑製劑結合的位點，但是 「如果你仔細觀察它們的表面，它們還是有很多角落和縫隙」 讓蛋白降解劑與之結合，耶魯大學的Crews博士說。

而且有證據表明這種分子中與靶點蛋白結合的部分不需要傳統小分子藥物所需要的選擇性。藥物開發人員通常希望他們開發的分子只與想要結合的靶點相結合，因為與其它蛋白相結合的藥物可能導致毒副作用。但是學術界的研究人員反覆證明選擇性不強的抑製劑可以變成特異性很高的蛋白降解劑。這種選擇性產生的原因還沒有被完全解釋清楚，但是研究人員指出泛素標記的過程需要降解劑能夠在合適的時間扭曲成合適的形狀。

對於小分子抑製劑來說，「結合能力是所有問題的關鍵，」 諾華公司的Bradner博士說：「但是蛋白降解過程包括了多個機械步驟。你需要完成的是一個催化循環。」

向未知進軍

即便研究人員在設計蛋白降解劑時不再需要遵守以前的藥物化學規則，這並不意味著靶向人類蛋白組的降解劑一下子變得唾手可得。

「從定義上來說，一個 『無法成藥』的蛋白靶點是不能用小分子來靶向的，」 加州大學伯克利分校的化學蛋白組學專家Daniel Nomura博士說。目前發表的雙功能分子結合的靶點蛋白都是已經被研究得很透徹的具備高親和力靶點的蛋白。例如，Arvinas公司今年將推入臨床試驗的兩種蛋白降解分子的靶點都是被充分研究過的蛋白。一個是雄激素受體，它是前列腺癌的靶點，另一個是雌激素受體，它是乳腺癌靶點。迄今為止，還沒有任何實驗室公開發布一個靶向無法成藥靶點的強力分子。

▲Arvinas的研發管線（圖片來源：Arvinas官方網站）

研究人員正在採用多種手段來尋找與這些困難靶點相結合的配體。Nomura博士的實驗室開發了一種方法能夠使用共價小分子來探索蛋白表面，尋找能夠與之結合的部位。「我們發現的許多位點從靜態晶體結構的角度看來都不是顯而易見的位點，」他說。

生物技術公司指出DNA編碼化合物庫可能是尋找蛋白降解劑的最佳起點。高通量篩選找出的是調節蛋白活性的化合物，而DNA編碼化合物庫找出的是與蛋白相結合的分子。這項技術讓生物技術公司可以篩選上百萬，甚至幾十億種攜帶DNA標籤的化合物，從中找出與蛋白結合的先導化合物。Arvinas公司生物學負責人Ian Taylor先生指出，DNA編碼化合物庫不但能夠幫助找出與蛋白結合的化合物，而且DNA標籤是構建蛋白降解劑中鏈接部分的自然起點。

另外一種發現與蛋白結合分子的方法是重新審視那些已知可以與蛋白靶點相結合但是出於其它原因無法成藥的化合物。它們可能包括以前的候選藥物，它們可能不夠強力或者有脫靶效應，但是理論上這些分子可能成為蛋白降解劑的一部分。

除了發現能夠與以前無法成藥的蛋白結合的配體以外，研究人員也希望能夠對雙功能分子的另一端進行改良。雖然人類泛素-蛋白酶體系統包括了超過600種E3連接酶，科學家們目前只找到能夠與幾種E3連接酶結合的配體。

研究人員希望能夠發現與其它E3連接酶結合的配體，這將擴展蛋白降解劑的能力。例如，發現與只在特定組織中起作用的E3連接酶相結合的配體將幫助藥物開發人員設計出更好的藥物。

「發現打開大自然E3連接酶收藏的鑰匙將是這一領域的重要中期目標之一，」 C4 Therapeutics公司的主席兼首席科學官Andy Phillips先生說。

展望未來

如果研究人員想要探索人類蛋白組中的更多蛋白的話，它們需要將藥物研發過程工業化。在蛋白降解劑研究初期，發現的分子大多是經驗主義的結果。「我們顯然需要將這一領域帶入基於結構的藥物設計的現代化時代。」 鄧迪大學 (University of Dundee) 的Alessio Ciulli博士說。

▲Ciulli博士課題組解析了蛋白降解藥物與靶點結合的晶體結構（圖片來源：Ciulli博士實驗室）

風投資金的湧入和大型醫藥公司的重視將幫助這一現代化過程的進行。「我們在儘力去除這項技術中經驗主義的部分，」Kymera公司的CEO Laurent Audoly 先生說。他補充道該公司已經建立起一個藥物研發平台來設計出出色的分子。

用理性進行藥物設計，不但對加快藥物研發過程非常重要，而且可以幫助理解我們應該著重研究哪些靶點。目前的現實情況是化學家們無法預測哪些蛋白可以被降解，也不知道它們能否進入一些如大腦那樣的難於進入的組織。

除了了解哪些蛋白可以被降解以外，研究人員需要解決一個蛋白是否應該被降解的問題。這些雙功能分子 「可能在體內產生深遠的影響，「 BenevolentAI公司的藥物研發副總裁Ian Churcher先生說：」如果藥理學給與你的是藥效，那當然是很好的事，但是如果藥理學給你的是毒性，那就很糟糕了。」BenevolentAI公司力圖使用人工智慧分析工具來找出哪些靶點具備最大可能在治療疾病的同時不產生危險的副作用。

雖然研究人員指出這一領域仍然有很多工作需要完成，但是他們同時也非常高興蛋白降解劑將進入臨床試驗的階段。觀察這些分子能否安全地在人體中降解蛋白將是「驗證這些分子能不能成為藥物的第一個信號」， C4公司的Phillips先生說。

Arvinas公司希望它的靶向雄激素受體的PROTAC能夠在今年十月開始臨床試驗。靶向雌激素受體的候選藥物可能在年底進入臨床試驗。

研究人員對蛋白降解劑的未來充滿信心。「自從我加入諾華以來，我們的科學家們已經成功降解了超過30種蛋白，「 Bradner博士說：「只要有許多化學和一點點運氣，我們可以降解幾乎任何蛋白！」

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