新型「多炔彩虹」探針突破色彩極限：振動成像技術助力複雜體系的研究

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顯微成像技術是現代生命科學研究中應用廣泛、不可或缺的技術之一。光學顯微鏡、電子顯微鏡乃至掃描顯微鏡為研究人員深入分子水平探索生命科學提供了極為豐富的時間及空間維度的信息。其中光學顯微鏡，特別是熒光顯微鏡對樣品製備要求較低，靈敏度高，可進行活體檢測，在生命科學領域已得到廣泛的應用。近年來，基於超分辨熒光顯微技術，熒光顯微鏡更是得到了業界的青睞。儘管如此，熒光顯微技術仍受到熒光現象本身的約束，特別是在多通道檢測（Multiplexing）方面能力不足。

美術設計：哥倫比亞大學Nicoletta Barolini

多通道檢測是利用不同信號的不同特點，在同一平台或介質中進行多個信道的檢測。除時間和空間外，通道數也可以視為一種測量的維度，這一概念反映在熒光顯微鏡上是指同時進行多種顏色的熒光信號檢測。多通道檢測技術極大地促進了對複雜生命體系的研究，例如對多種細胞器或蛋白質進行成像、高通量藥物篩選或醫療診斷。不僅如此，多通道檢測技術還應用於大規模的信息存儲及數據安全領域。近一個世紀以來，用於熒光檢測的探針數目可謂恆河沙數，包括小分子熒光探針、量子點、稀土金屬上轉換材料以及熒光蛋白等等。儘管這些熒光物質早已將整個可見光領域（400 nm - 700 nm）覆蓋，但仍然不得不面對熒光本身存在的局限：熒光發射光譜基於電子能級躍遷產生，其峰寬一般約為50 nm - 100 nm。換言之，有限的可見光區間難以同時容納並檢測出超過六種的熒光分子。現如今大數據的時代即將到來，生命科學的研究越來越依賴於信息的獲取與積累。當人們需要更多的通道數、更快的檢出速度、更廣的信息容量時，這一限制便讓熒光顯微技術捉襟見肘。

近日，美國哥倫比亞大學化學系的閔瑋教授研究團隊報道了一種基於多炔（Polyyne）分子的成像方法。該方法利用拉曼散射顯微鏡（Raman Scattering Microscopy）平台並巧妙地設計合成了20種振動頻率不同的多炔。通過進一步的探針分子修飾，作者成功實現了10種「顏色」的細胞器同時在單個活細胞里的成像。另一方面，作者還展示了如何用多炔分子進行光譜學編碼（Barcoding）來實現信息存儲和讀取。該成果以全文的形式發表在Nature Methods上。Nature雜誌的Technology Blog在2018年初亦撰文詳細報道了這套「多炔彩虹」在超多通道顯微技術上的獨特應用。

振動光譜（主要包括紅外吸收光譜及拉曼散射光譜）明顯優於熒光光譜，其峰寬（~1 nm）遠遠小於熒光光譜，這一優勢為多通道的光學檢測提供了極為有利的先決條件。然而，伴隨窄峰寬而來的是振動光譜的複雜性：即便一種分子的振動光譜已是犬牙交錯，常常難以準確歸屬，更何況是複雜的生命體系。解決這一問題需要開發相應的振動探針分子，儘管生命體系內的分子紛繁複雜，但有趣的是，三鍵（如炔鍵或氰基）十分少見，從而在振動光譜上產生一段細胞靜默區域（Cell Silent Region, 1800-2600 cm-1）。以此為基礎，結合高靈敏度的拉曼散射顯微鏡，基於三鍵的探針分子就可以實現低背景、高信噪比的檢測。作者利用Glaser–Hay和Cadiot–Chodkiewicz偶聯反應合成了一系列擁有多個三鍵的共軛多炔分子。為了調節分子的振動頻率，使這些分子能夠進行多通道檢測，作者採取了以下三種策略：

1）改變炔鍵的數目。隨著參與共軛的炔鍵數目從2增加至6，作者發現其振動光譜均只呈現一個很強的主峰，峰的頻率從2226 cm-1幾乎線性地位移到2066 cm-1，這些峰彼此可以很好地分離。另一方面，隨著炔鍵數目的增加，峰的強度表現出超線性的增強。六炔與二炔相比，強度增強了約30倍，表明更多的炔鍵不僅可以提供更多選擇的振動頻率，還可以極大地提高檢測的靈敏度。

2）同位素修飾。在振動光譜的經典力學描述中，振動頻率取決於化學鍵的強度和摺合質量：

如果利用同位素來改變m1和m2，分子的振動頻率也會因此改變。作者通過在多炔中選擇性地摻入含13C的炔鍵，成功調節了多炔分子的振動頻率。

3）末端取代基的修飾。末端取代基的推拉電子效應也可以改變炔鍵的振動頻率。作者嘗試了強吸電子基團如三氟甲基，強給電子基團如氨基以及電中性的亞甲基等，還嘗試改變取代基的取代位點，進一步地微調分子的振動頻率。相比前兩種策略，取代基的改變可以實現更加精細的調節。

綜合以上三種策略，閔瑋團隊合成出二十種頻率各異的多炔分子，這些分子很好地覆蓋了從2000 cm-1到2300 cm-1區間的頻率，並表現出很高的解析度。作者將這一系列的分子貼切地命名為「Carbow」（即Carbon Rainbow）。

Carbow系列的分子結構及振動光譜一覽

利用這一系列的分子，作者進行了多種多通道檢測的應用，首先是活細胞中細胞器的標記實驗。作者利用定向的細胞器親和官能團對探針分子進一步修飾，使其具備特異性標記細胞器的能力。經過與商用熒光染料共定位的對比，這些探針分子表現出與之幾乎無異的標記能力，甚至具有更強的光穩定性和更弱的細胞毒性。作者進一步使用五種Carbow細胞器探針與五種熒光探針進行共染，成功實現了活細胞內多種細胞結構的10色成像，相比以往報道的最多6色成像，該方法具有目前已知的最多檢測通道數，且無需任何後期的譜學分辨手段。

五種Carbow細胞器探針及其對應的共染實驗

Carbow探針與熒光探針的10色成像

作者還展示了如何利用Carbow分子進行光學信息編碼。他們將一系列的Carbow分子混合，每一種頻率就是一個信道，頻率對應的強度就是信號，不同的分子組合可以產生海量的編碼信息。基於熒光的編碼手段已經在高通量醫學檢測中得到應用，然而受限於熒光有限的信道數以及不同分子間的干擾（自淬滅、能量轉移等），熒光編碼的數量仍然有限。得益於振動光譜的優勢，作者將Carbow系列進行組合編碼，選取3微米直徑的聚苯乙烯顆粒作為載體，將不同比例的多種Carbow分子吸附於其中，並設定三種檢出信號強度0、1和2，從而得到多種不同編碼的聚苯乙烯顆粒。相比於以往報道的最多1000種熒光編碼，僅僅利用10種Carbow分子和0、1、2的數碼，他們便可得到310-1=59048種編碼。結合快速的檢測手段如細胞流式儀，這一手段將極大推動高通量醫學診斷技術和藥物篩選的發展。

另一方面，作者認識到這種編碼除了可以用於體外檢測，還可用於標記細胞，即賦予細胞一個ID。得益於顆粒的小尺寸和低毒性，細胞可以將若干顆粒內吞，不同顆粒的組合可以為細胞生成一個獨一無二的身份編碼。作者通過實驗證明了這一理念：吞入細胞的顆粒在拉曼顯微鏡下可以清晰地觀察到並讀取其編碼。假定每個細胞平均可以吞入3個顆粒，則59048種編碼段可以進一步組合產生59,048C3=3×1013個ID，這一數目足以標記人體內的所有細胞。

10種Carbow分子的光學編碼

自發拉曼顯微鏡下可對單一顆粒進行信息讀取和識別

作者認為，Carbow系列分子具有廣闊的應用前景。分子的設計巧妙且易於合成，呈中性利於活體內應用，可直接進行超多通道檢測而不需要任何後期譜學處理。作者也指出，該技術將著眼於以下幾點發展，如進一步擴展多炔分子產生更多的振動頻率；與快速的成像方式結合，推動生命體內動態過程的研究；在編碼方面，可以對載體顆粒進行功能化，如與特定的抗體或酶結合，協同細胞流式技術進行高通量多通道的篩選和檢測。閔瑋團隊表示，Carbow系列分子結合了精巧的分子設計、先進的光學顯微鏡技術和課題組在生物成像領域內多年的積累，是該課題組學科交叉氛圍下的優秀成果。該技術有望助力複雜生命體系的研究，讓紛繁複雜的生命過程撥雲見日。

閔瑋團隊長期致力於結合光學成像技術和化學合成發展超多通道檢測技術。此前，閔瑋課題組於2017年初在Nature上報道了MARS（Manhattan Raman Scattering）系列探針（點擊閱讀相關）。該系列探針結合電子預共振受激拉曼散射顯微鏡（epr-SRS Microscopy）實現了超多通道的生物成像。該研究經Nature和Nature Methods等專題報道，引起了強烈反響。閔瑋教授表示，Carbow系列探針作為課題組系統開發的第二代探針，進一步豐富了拉曼探針家族。相比MARS系列，Carbow探針無需電子預共振，適用於自發拉曼顯微鏡，因而擴大了其應用平台，使這項技術從實驗室研究推向市場，有望使用商業儀器進行檢測，通過後續的信號放大在很多領域如免疫標記領域具有廣闊的前景。

該論文的共同第一作者為胡昉昊博士和曾臣博士。胡昉昊博士本科畢業於武漢大學，2017年於哥倫比亞大學博士畢業，主要從事受激拉曼散射光譜、顯微成像、編碼和生物應用的工作。曾臣博士於中國科學院上海有機化學研究所獲得博士學位，目前作為博士後在閔瑋課題組從事拉曼探針設計與合成的研究。此外，龍榕博士參與了部分Carbow分子的合成工作，博士生苗宇鵬參與了聚苯乙烯顆粒的編碼實驗。

閔瑋教授現任哥倫比亞大學化學系終身教授，2003年本科畢業於北京大學，2008年於哈佛大學獲得博士學位，師從美國科學院院士、中國科學院外籍院士謝曉亮教授，2010年起執教哥倫比亞大學化學系，2017年成為正教授。閔瑋教授的團隊多年來致力於開發基於分子光譜學的新型光學顯微鏡，結合化學探針和生物技術，推動神經科學、癌症檢測和疾病診斷等前沿生命科學和醫學研究的發展。

該論文作者為：Fanghao Hu, Chen Zeng, Rong Long, Yupeng Miao, Lu Wei, Qizhi Xu & Wei Min

Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes

Nat. Methods,2018, DOI: 10.1038/nmeth.4578

導師介紹

閔瑋

http://www.x-mol.com/university/faculty/1407

Nature和Nature Methods等專題報道：

1. Nature | News and Views Microscopy: A larger palette for biological imaging

http://www.nature.com/nature/journal/v544/n7651/full/544423a

2. Nature Methods | Research Highlights Microscopy: Good vibrations for super-multiplexed imaging

http://www.nature.com/nmeth/journal/v14/n6/full/nmeth.4319

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