1321期-3：技術免疫檢測中的反應模式

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在免疫檢測中，即使相同的項目，也常常有不同的反應模式。這些模式各有特點，其中夾心法、競爭法可用於檢測抗原，也可用於檢測抗體；間接法、捕獲法僅可用於檢測抗體。

下面為大家介紹各種反應模式的特點。

夾心法

夾心法分為檢測抗體的雙抗原夾心法和檢測抗原的雙抗體夾心法。其中雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，可用於檢測有兩個及兩個以上抗原決定簇的多價抗原，但無法檢測小分子半抗原。

雙抗體夾心法的基本原理是，將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體；加入待測樣本，孵育使樣本中的抗原與固相抗體充分反應，形成固相抗體-抗原複合物，之後洗滌除去其他未結合物；加入標記特異性抗體並孵育，使標記抗體與固相抗體-抗原複合物結合，形成固相抗體-抗原-標記抗體複合物（雙抗體夾心），洗滌除去未結合的標記抗體；最後根據不同的方法學，加入不同的反應物質（如酶促底物、鹼性溶液、氧化劑等），得到反應信號；讀取信號，根據預先設定的COV或標準曲線，進行定性或定量的結果判讀[1]。過程如圖1所示。

經典的夾心法均為兩步法，即待測樣本與標記抗體（或抗原）分兩次加入反應體系，兩次分別進行孵育和洗滌。

由於兩次孵育和洗滌會延長反應時間且操作繁瑣，在經典的夾心法基礎上，發展了一步夾心法，即待測樣本與標記抗體（或抗原）同時加入反應體系，共同進行孵育，之後共同洗滌。但一步夾心法可能帶來鉤狀效應，高滴度樣本可能出現假陰性結果，兩步法可以避免這樣的情況發生。

雙抗體夾心法易受干擾。常見的干擾物質包括[2]人抗動物抗體（HA）和類風濕因子（RF），可造成假陰性及假陽性結果。HA是人抗動物抗體，結合力較弱，可與來自不同物種的免疫球蛋白反應，這些物種包括小鼠、山羊、兔子、綿羊和雞。在診斷檢測過程中，HA可結合多種類型的無關抗原，從而干擾抗原-抗體的特異性結合反應，如一個干擾抗體分子分別與固相抗體及標記抗體結合，儘管樣本中沒有待測抗原的存在，標記抗體通過干擾抗體連接到固相抗體，在洗滌過程中不會被洗去，因此產生了相應的信號，造成假陽性結果；或干擾抗體分別與固相抗體及標記抗體結合，佔據固相抗體與標記抗體上的特異性結合位點，使待測抗原無法結合到位點上，無法形成固相抗體-待測抗原-標記抗體複合物，在洗滌過程中，因標記抗體未能通過待測抗原連接到固相抗體而被洗去，造成無法產生相應的信號，造成假陰性結果，如圖2所示。

RF可以與人自身的免疫球蛋白結合，同時也可以與動物的免疫球蛋白交叉反應，從而產生和HA干擾類似的RF干擾。

為解決這一問題，要求在體外診斷試劑研發生產過程中，需要在檢測樣本的過程中使用其他的阻斷劑以防止內源性干擾物質與檢測試劑組分抗體結合，避免反應過程中出現的干擾。

能夠阻斷檢測過程中出現的干擾的阻斷劑分為主動阻斷劑和被動阻斷劑。被動阻斷劑主要包括常用動物的IgG，其工作原理是通過與干擾抗體結合，以提供可選結合位點來檢測抗體，見圖3。一類動物IgG（如羊IgG）只能封閉一種類型的干擾物質（如人抗羊抗體），因此通常選用不止一種類型的IgG。

在鼠雙抗夾心法試驗中，需要使用特異性阻斷劑來去除特定的異嗜性抗體HA干擾，異噬性抗體HA主要包括人抗鼠抗體（HAMA）和類風濕因子（RF）的干擾，這個過程中使用的特異性阻斷劑就是我們通常所說的主動阻斷劑。這一類阻斷劑能夠特異性識別抗體的Fab段位點並進行封閉，使干擾抗體無法與待測抗原抗體或試劑中的抗原抗體反應，避免檢測結果受到干擾。

在實際使用過程中，主動阻斷劑的用量通常小於被動阻斷劑，主要為了減少使用過多被動阻斷劑導致的信號減小等副作用。

雙抗原夾心法檢測抗體的原理與雙抗體夾心法類似，特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗原；加入待測樣本，孵育使樣本中的抗原與固相抗體充分反應，形成固相抗原-抗體複合物，洗滌除去未結合物質；加入標記特異性抗原並孵育，是標記抗原與固相抗原-抗體複合物結合，形成固相抗原-抗體-標記抗原複合物（雙抗原夾心），洗滌除去未結合的標記抗原，加入反應物質，判讀結果。

間接法

間接法僅能檢測抗體，是檢測抗體常用的方法。間接法的基本原理是，將特異性抗原包被在固相載體上，加入待測樣本，使待測樣本與固相載體上的抗原結合，形成固相抗原-受測抗體複合物；孵育洗滌後，加入標記抗體，標記抗體是針對待測抗體的抗體，通常為羊抗人IgG，它能夠與受測抗體的Fc段結合，形成固相抗原-受測抗體-標記抗體複合物；孵育洗滌洗去未結合的標記抗體。過程如圖5所示。

通常，間接法使用的標記抗體僅針對一類免疫球蛋白分子，通常採用的是抗人IgG，嚴格來說，所測僅包括抗體的IgG類，不涉及其他種類抗體。在這種情況下，間接法的檢測各類IgG抗體時所用的標記抗體是通用的[1]，成本較低。

間接法檢測IgG容易受到樣本中較高濃度的非特異性IgG干擾，因此通常待測樣本需要進行稀釋，或使用阻斷劑以避免干擾抗體的影響。

儘管通常情況下，間接法僅用於檢測IgG，但利用IgG吸附劑清除樣本中的IgG抗體後，間接法也可用於檢測IgM抗體；採用不同標記抗體時，可同時檢測IgG與IgM抗體。

競爭法

競爭法可檢測抗體，也可檢測抗原。

在抗原檢測中，主要用於小分子抗原或半抗原（如藥物、激素等）的檢測，大分子抗原通常採用夾心法檢測。因小分子抗原或半抗原只有一個抗原決定簇，無法採用夾心法。

競爭法的基本原理是先將抗小分子抗原的特異性抗體包被在固相載體上，然後同時加入待測樣本與標記小分子，待測樣本中的小分子與標記小分子競爭與固相抗體相結合，溫浴一定時間後洗滌，根據不同的方法學，加入不同的反應物質（如酶促底物、鹼性溶液、氧化劑等），得到反應信號；讀取信號，根據預先設定的COV或標準曲線，進行定性或定量的結果判讀，過程如圖6所示。

競爭法的主要特點是，其反應信號強度與樣本中待測小分子的含量負相關。採用競爭法時需注意，標記小分子與受測小分子與固相抗體結合的能力應該相當，以避免不公平競爭而產生的假陰性或假陽性結果。在競爭法反應體系中，固相抗體和標記抗原的量是固定的，且前者的結合位點少於標記抗原與受測抗原的總量，因此能夠由結合後的信號強度說明樣本中受測抗原與標記抗原含量的比例。

競爭法檢測抗體的原理與檢測抗原類似。其中，抗原與固相載體的連接，可直接進行，也可通過特異性抗體進行間接固相化，如抗-HBe常用的檢測體系中，先將抗-HBe包被在固相載體上，同時加入待測樣本和中和抗原HBeAg，此時待測樣本中的抗-HBe和固相抗體競爭結合中和抗原HBeAg。因此，待測樣本中抗-HBe濃度越高，與固相抗體結合的中和抗原越少。孵育後洗滌，加入標記的特異性抗體，再進行孵育使之與已結合在固相抗體上的中和抗原相結合，形成固相抗體-中和抗原-標記抗體複合物。

競爭法易受到外界條件變化的干擾，如直接競爭易受到加樣本與競爭抗體（抗原）的間隔時間影響[3]；樣本中的內源性抗體影響；溶血、脂血、RF等影響[4]。在操作過程中需特別注意按要求進行實驗。

捕獲法

捕獲法又稱反向間接法，可測定血清中某種特定的免疫球蛋白，目前主要用於IgM抗體的檢測。由於血清中大量的IgG會感染IgM的測定，通常包被的固相抗體為針對IgM分子μ鏈的抗體，加入待測樣本後，特異及非特異的IgM抗體都會被固相抗體捕獲，之後加入能夠與特異性抗體結合的已知抗原，再加入能夠與已知抗原相結合的標記抗體。如圖7所示。通常，相比於間接法，捕獲法檢測血清樣本中的IgM抗體靈敏度更高[5]。

捕獲法易受到非特異性IgM及RF（IgM類）的干擾。RF（IgM類）可結合到故鄉抗體上，再與標記抗體發生反應，從而造成假陽性結果，非特異性IgM抗體與固相抗體結合後，會影響試劑的靈敏度，血清中大量的IgG抗體也會影響檢測。為增加靈敏度，可在試劑中添加IgG吸附劑，即純化後的羊抗人-IgG Fc片段，這樣能夠在檢測前去除血清中的IgG抗體及RF。IgM檢測過程中，通常還會對樣本進行稀釋，減少干擾，提高靈敏度，如圖8所示。

參考文獻：

1.王蘭蘭等,臨床免疫學與檢驗.北京:人民衛生出版社, 2008:103-107

2.宋海波等,中國體外診斷產業發展藍皮書(2016年第二卷). 2017:178-182

3.吳淑梅等,競爭抑製法檢測抗-HBc總抗體的影響因素及對策, [J].檢驗醫學, 2006, 21(4):376-379

4.譚立明, ELISA法檢測的影響因素及其對策, [J].實驗與檢驗醫學, 2013,31(4):300-305

5.Paweska JT, Burt FJ, et al, IgG-sandwich and IgM-capture enzyme-linkedimmunosorbent assay for the detection of antibody to Rift Valley fever virus indomestic ruminants.[J].Virol Methods. 2003 Nov;113(2):103-12.

來源：燈塔光免小助手 作者： KHB市場部 劉一陽

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