景乃禾、湯富酬合作團隊揭示胚胎胚外發育基因沉默的差別表觀遺傳機制

最近幾年，隨著各種基於少量細胞的表觀遺傳學研究手段的快速發展（如針對DNA甲基化的亞硫酸氫鹽測序、針對組蛋白修飾的染色質免疫沉澱測序、針對染色質開放程度的ATAC-seq、針對染色質高級結構的HiC-seq等），關於哺乳動物胚胎髮育過程中的表觀遺傳學動態變化規律的研究不斷深入。這其中，北京大學湯富酬教授、同濟大學高紹榮教授、清華大學頡偉教授、中科院北京基因組所劉江研究員等都作出了大量傑出的工作【1-4】。然而針對小鼠胚胎早期發育過程中細胞命運決定及發育潛能維持與喪失的表觀遺傳調控機制研究還很不深入。

2月20日，中科院上海生物化學與細胞生物學研究所景乃禾研究員實驗室和北京大學湯富酬研究員實驗室合作在Cell Research雜誌在線發表了題為「Silencing of developmental genes by H3K27me3 and DNA methylation reflects the discrepant plasticity of embryonic and extraembryonic lineages」的研究論文。該論文揭示了原腸運動時期胚胎不同部位細胞的DNA甲基化和H3K27me3修飾模式的變化規律，並發現了發育相關基因在胚外區域富集DNA甲基化修飾、在胚胎區域富集H3K27me3修飾的現象,闡明了兩種表觀調控機制對於介導胚外和胚胎部分細胞發育潛能差異的重要作用。

細胞命運決定過程的調控機制是發育生物學及幹細胞研究領域的關鍵問題之一。在小鼠胚胎早期發育過程中，具有全能性的合子細胞經過不斷的細胞增殖後逐漸特化形成滋養外胚層（TE）和內細胞團(ICM)細胞。其中TE繼而形成胚外外胚層等細胞，並最終形成胎盤組織等；ICM細胞則發育形成原始內胚層細胞和上胚層細胞，上胚層細胞經過原腸運動形成外、中、內三個胚層，將來發育形成完整個體。前期研究表明，內細胞團和滋養外胚層在轉錄組上已經呈現出較大差異，而此時兩種類型的細胞在表觀修飾上的差異尚不明顯。隨著胚胎髮育的進行，胚外部分和胚內部分細胞的發育命運不斷固化，表觀遺傳調控在該過程中是否發揮作用尚不清楚。

2016年3月，景乃禾課題組在Developmental Cell上首次報道了小鼠原腸胚中期的空間轉錄組圖譜，揭示了調控胚胎髮育的關鍵基因在胚胎中不同位置的表達情況，為進一步理解小鼠胚胎髮育過程尤其是原腸運動過程中的細胞命運分化及可塑性的分子機制奠定了基礎【5】。

2017年7月，美國Broad研究所Alexander Meissner教授在Nature上報道了其對小鼠早期胚胎胚外和胚內細胞的DNA甲基化分布模式的研究成果【6】。該文報道了在小鼠著床後胚胎中胚外外胚層細胞中發育相關基因被高度甲基化的現象，並進一步對比了胚外發育相關基因的高DNA甲基化模式與腫瘤細胞中的DNA甲基化分布模式之間的相似性，分析了發育關鍵基因的表觀調控機制在疾病發生過程中的重要作用。然而，這種差異DNA甲基化分布對於胚胎髮育的意義以及是否存在其他表觀機制介導胚內部分細胞命運的多樣化，尚不清楚。

在最新的這項研究成果中，研究人員為了進一步探究小鼠胚胎髮育過程中的表觀遺傳學機制，建立了基於少量細胞的染色質免疫沉澱技術和亞硫酸鹽測序技術等。結合不同胚胎區域的發育命運，將小鼠原腸胚切割形成胚外部分、前端部分、後端部分等，細緻研究了小鼠著床後胚胎不同部位細胞的組蛋白H3K27me3 修飾和DNA 甲基化修飾的變化規律和分布特點。研究結果表明，DNA甲基化在可轉座元件序列區域的富集水平要遠高於基因啟動子區域的分布；H3K27me3則呈現出相反的趨勢，即在基因啟動子區域的富集程度要高於可轉座元件區域的富集水平。且從著床前到原腸胚階段，DNA甲基化水平的增長主要發生在轉座元件區域，H3K27me3的重建則主要發生在基因啟動子及調控元件區域。

通過將基因組上所有基因按照啟動子區域的CpG含量分為高、中和低三類並進一步分析上述兩種表觀修飾在這三類啟動子區域的富集情況，研究人員發現在小鼠原腸胚中H3K27me3在胚內區域的高CpG含量啟動子附近的富集程度明顯高於其在胚外區域的富集程度。通過與著床前胚胎中的分布進行對比，研究人員發現這種差異在著床前胚胎中的ICM和TE之間並不存在，僅在著床後胚胎中出現。對這部分基因的進一步研究表明，胚內區域和胚外區域存在顯著H3K27me3富集程度差異的基因多與胚胎髮育密切相關，且其中相當一部分基因的啟動子（515/1，760）區域呈現出胚內區域的低DNA甲基化、胚外區域的高DNA甲基化分布。

針對這種現象，研究人員推斷這種表觀修飾分布上的差異可能對於介導胚外區域和胚內區域發育命運上的差異、促進胚內區域多種細胞命運的形成等具有重要作用。為了驗證這種不同胚胎區域表觀修飾的分布差異及其對發育相關基因的調控作用，研究人員利用體外外植體培養實驗短時培養小鼠原腸期胚胎，通過向培養體系中添加H3K27me3特異性抑製劑處理後，觀察分析不同胚胎組分細胞基因表達響應性上的差別。結果表明添加H3K27me3特異性抑製劑處理後，可顯著上調胚胎區域發育相關基因的表達水平，而胚外區域則不受影響。如對原腸胚後端高表達且對原條及中內胚層發生至關重要的基因T，在處理後呈現出在前端部分細胞中的顯著上調、後端和胚外細胞中則無明顯變化。由此可以推斷髮育相關基因T在胚外部分受到DNA甲基化的調控、胚內前端部分受到H3K27me3的調控來維持其在兩部分細胞中的低表達，並進而促進原腸胚後端原條及中內胚層的形成和原腸胚胚胎模式的建立。

綜上，該研究結果為闡明不同表觀調控對細胞命運及發育可塑性的影響、認識幹細胞的全能性與分化潛能以及幹細胞轉化醫學應用等提供了全新的視角和理論指導。

據悉，中科院上海生化細胞所與上海科技大學聯合培養博士生楊賢法、北京大學博士生胡博強及侯宇、廣州大學生命科學學院喬雲波為本文共同第一作者，景乃禾研究員、湯富酬教授和喬雲波博士為論文共同通訊作者。

參考文獻：

1Guo, H. et al. The DNA methylation landscape of human early embryos.Nature511, 606-610, doi:10.1038/nature13544 (2014).

2Liu, X. et al. Distinct features of H3K4me3 and H3K27me3 chromatin domains in pre-implantation embryos.Nature537, 558-562, doi:10.1038/nature19362 (2016).

3Zhang, B. et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.Nature537, 553-557, doi:10.1038/nature19361 (2016).

4Ke, Y. et al. 3D Chromatin Structures of Mature Gametes and Structural Reprogramming during Mammalian Embryogenesis.Cell170, 367-381 e320, doi:10.1016/j.cell.2017.06.029 (2017).

5Peng, G. et al. Spatial Transcriptome for the Molecular Annotation of Lineage Fates and Cell Identity in Mid-gastrula Mouse Embryo.Dev Cell36, 681-697, doi:10.1016/j.devcel.2016.02.020 (2016).

6Smith, Z. D. et al. Epigenetic restriction of extraembryonic lineages mirrors the somatic transition to cancer.Nature549, 543-547, doi:10.1038/nature23891 (2017).

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