ELISA常見問題分析

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ELISA(酶聯免疫吸附法)是一種快速檢測臨床和實驗樣品中蛋白質含量的方法，根據研究需求，有許多方式可供選擇，如直接ELISA，間接ELISA，競爭性ELISA和夾心ELISA等。ELISA是生物學實驗常用的一種技術，其具有快速、易於操作等優點，但當條件不合適時，其往往不能給出最佳的結果，不能保持一致性和可複製性。此時，我們需要快速調整相應的實驗步驟，如下為一些常見的問題和解決技巧。

一、信號強度低

如果你得到多個讀數低於吸光度的下限(

解決方案：

a.增加抗體的孵育時間。如果協議指示抗體在室溫孵育2小時，而得到的結果不好，嘗試在4°C孵育過夜。這額外的時間將允許最大的抗體結合，應該會導致信號的增加。

b.增加二抗--酶共軛物的濃度。ELISA中的E代表酶(通常是辣根過氧化物酶/HRP)，它與基質(通常是TMB)發生反應，產生一種充滿活力的藍色。將HRP濃度增加50%，或加倍，會產生更強的顏色。

c.TMB底物避光保存，使其性能最大化。保持ELISA板在黑暗中，因為TMB對光非常敏感。

二、高背景

ELISA板上的空白孔起陰性對照的作用，任何明顯高於0的值都表示有背景問題。或者，你可能正在檢測其他而不是你的待測物。

解決方案：

是否按照協議徹底清洗? 清洗板孔所需的體積是很重要的。由於毛細管作用，孔表面的溶液稍微升高，所以清洗緩衝液需要到達孔的頂部才能完全清洗。但是要小心，因為清洗太多會削弱信號。

三、意想不到的ELISA數據

你期望一個樣本值比另一個樣本值高，相反得到的值遍布整個區域，濃度與你所期望的相差甚遠。

解決方案：

a.標準曲線是否正確？協議是否規定了線性，4或5參數曲線? 檢測你所使用的擬合方式。

b.標準品是否有合理的數值?如果標準品沒有呈線性減少或增加，那麼應該放棄樣本濃度的計算，錯誤的標曲無法得到準確的樣本值。

四、干擾

干擾物質如洗滌劑或NADH(在血清中存在)會影響你的吸光度閱讀，並使你的結果不準確。

解決方案：

a.仔細閱讀協議。對干擾物質敏感的協議通常會告訴你它們是什麼，以及如何避免它們。

例如，如果使用血清實驗，血紅蛋白會干擾，建議不要使用溶血的血清樣本(溶解的紅細胞中有紅色)

b.你可能別無選擇，只能使用含有干擾物質的樣品。如果你的目的抗原濃度很高，用一個

很低但仍然很容易被檢測到的稀釋樣品，這樣可以稀釋干擾物質。

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