掌握這些細節，你就是ChIP實驗大神

ChIP-seq是一種結合染色質免疫共沉澱和二代測序來研究蛋白與DNA之間相互作用的技術，可用於鑒定轉錄因子的結合位點、比較不同樣本之間組蛋白修飾的變化及檢測等位基因之間的差異結合。在這類研究中，很多因素都會影響研究結果，我們要掌握其中一些關鍵細節才能得到一個近乎完美的結果，接著小編帶著大家一起去看下到底都是哪些細節。

樣本準備

ChIP實驗樣本需求量視蛋白因子類型和樣本類型而定。對於組蛋白修飾類型，因其屬於結構成分，結合丰度較大，只需較少量即可完成一次實驗，通常需要細胞量為10^5-10^6個；對於轉錄因子，結合丰度較小，需要細胞量達10^6-10^7個。對於組織，樣本需要量視樣本染色質提取情況而定，通常植物組織需求量為3~5g，動物組織為0.5~1g。

抗體準備

ChIP實驗對樣本的要求較高，最好是商業化ChIP Grade抗體，這類抗體擁有較好的特異性及耐受緩衝液洗滌作用。對於非商業化ChIP Grade抗體，若能在免疫印跡及免疫組化中表現良好且能通過IP檢測，易可進行ChIP實驗嘗試；對於TF類型，無商業化ChIP Grade抗體時也可進行轉基因操作，給目的TF融合Tag標籤。

下圖為小編檢索的組蛋白H3K4me3抗體的情況，排前兩位的均為ChIP Grade抗體，其中Merck Millipore的文獻引用最多，達521篇，但不全是做ChIP研究的，有興趣的老師可自己去點擊這521篇文獻查看。

值得注意的是，這些抗體裡面有些Application里寫的是「ChIP」，有些會寫「ChIP-seq」，兩者的區別在於「ChIP-seq」類抗體擁有更高的信噪比，在進行測序分析時能得到更準確的結合位點信息。

另外，根據經驗，一種商業化ChIP Grade抗體在不同物種中存在效率不同，因此小編建議在選擇抗體之前先查閱相關文獻，看研究同類物種或近緣物種中使用的是哪家品牌的抗體，再加以選擇，並借鑒文章中的抗體使用量。

對照選擇

ChIP實驗中的對照可分為：

陰性對照，IgG或mock；

陽性對照，RNA polⅡ或H3；

自身對照，Input；

樣本對照，生物脅迫或給葯的未處理樣本或轉標籤陰性樣本。

各對照各自的作用是什麼？

首先，陰陽性對照均是對實驗操作正確與否的判斷。理論上，陰性對照應富集不到產物或有很少量的產物，陽性對照應有較多的產物量，若不是滿足這種關係可判斷實驗操作失敗，需重新進行實驗。亦可根據陽性結合位點信息進行PCR或qPCR驗證實驗成敗。

其次，自身對照Input是起排除實驗背景的作用。這是因為本身我們染色質就存在開放和緻密區域，兩部分區域在染色質裂解過程中的效率不一樣，會造成部分偏差，另外在建庫及測序過程中也會存在一部分的偏向性，這些都會引起假陽性的實驗結果，需要利用自身沒有富集的產物同步進行去排除。嚴格來講，陰性對照是更適合作為對照來排除這部分背景的，因為其完全模擬了實驗樣本的操作情況，但其產物量通常很少，在建庫過程中會引入新的偏差，所以在測序過程中一般選擇Input作為對照樣本去排除背景。

值得注意的是，Input樣本數量怎麼選？是每個IP樣本均需要一個Input樣本嗎？小編認為不需要，如對同一份材料進行多個蛋白因子的實驗，如能保證實驗同一時間進行，則可只進行一份Input實驗；再如，生物學重複，Input也可選擇混合建庫測序的方式。但對於不同材料、不同時間進行的實驗，則必須保證一個IP產物對應一個Input同步建庫測序的方式。

樣本對照的則是為了找生物脅迫、給葯處理之後，蛋白因子結合情況的真實變化，或轉錄因子調控基因的真實情況。

文庫構建

ChIP小片段文庫的構建可選擇文獻中常見的幾種，如NEBNext Ultra II DNA文庫製備試劑盒、Illumina TruSeq ChIP文庫製備試劑盒等。需要的注意的是，建庫過程請盡量PCR處於線性擴增，避免測序較多重複片段，這些因為目前大部分的peak caller在進行call peak過程中均會過濾掉duplication的reads，過多duplication reads會影響有效數據量，對下游分析結果造成影響。

測序策略及reads長度

Single-end(SE) sequencing or paired-end(PE) sequencing ?

How long the reads should are ?

理解這兩個問題需要從以下幾個方面認識

1.PE sequencing和long reads均可提高比對（Bowtie）精確率與重複元件覆蓋率，兩者之間的權衡取決於預期數據的質量。

2.在call peak方面，PE sequencing產生更多的peak，但其質量（主要是motif預測及解析度）與SE sequencing相同。通俗來講，即PE sequencing會得到更多peak，但不影響motif的判斷。另外，reads length對call peak而明顯影響。

3.PE sequencing和long reads均可提高等位基因特異性結合檢測的解析度。

那麼，現在關於這兩個問題你有答案了嗎？

測序深度

隨著高通量技術的發展，測序成本逐步下降，那麼在ChIP實驗中測序深度應該如何選擇？

測序深度的選擇應該基於研究物種的參考基因組大小和蛋白因子類型而定，絕不該是一個統一的深度，選擇合適的測序深度可以在合理的花費情況下最大限度的去發現我們所要研究的信息。

下面以果蠅和人類為研究物種、組蛋白修飾為蛋白因子，去理解這個問題。

1.對於與活性啟動子相關的組蛋白標記如H3K4me3和H3K4me2，只需比較小的測序深度即可完成全基因組的有效覆蓋及call peak結果。Fly約10M reads左右，Human則需要20M reads左右。

2.而與轉錄相關的組蛋白標記如H3K36me3、或與增強子相關的組蛋白標記如H3K27Ac和H3K4me1，則需要更多一點的測序深度才可完成全基因組的有效覆蓋及call peak結果。Fly約15M reads左右，Human則需要30M reads左右。

3.對於抑制性組蛋白標記如H3K27me3和H3K9me2就需要較大的測序深度才可完成全基因組的有效覆蓋及call peak結果。Fly約20M reads左右，Human則需要40M reads左右。

4.對於核心組蛋白如H1和H4、或廣泛存在的組蛋白修飾則需要最大的測序深度才可完成全基因組的有效覆蓋及call peak結果。Fly約30M reads左右，Human則需要70M reads左右。

5.對於大多數轉錄因子，其作為點源因子結合在基因組範圍內，測序深度可與H3K4me3相當，Fly選擇10M reads，Human選擇20M reads即可。

對於其他組蛋白標記又該如下選擇合適的測序深度？下面以果蠅為例，闡述常見組蛋白標記所需要的測序深度。至於其他物種，小編給出經驗如下：1.對於和果蠅基因組相差不大的物種，按照果蠅相應標記選擇測序深度即可；2.若研究物種基因組大小比果蠅基因組大出一個數量級，則以相應標記的果蠅測序深度乘以2~3x即可。

那麼，今天的分享就到此為此，以上的這些你都掌握了嗎？

武漢愛基百客生物

主營ChIP-seq、RNA-seq、ATAC-seq

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