利用qPCR研究環境中微生物數量

今天，基迪奧生物正式開工啦~

新的一年，新的征程，祝各位老師同學在新的一年取得新的成果！有沒有人給小編髮開工紅包呀？不然點個贊也行啊~

在開工的第一天，給大家介紹一種利用qPCR對環境微生物進行絕對定量的方法。

qPCR（熒光定量PCR）實現了PCR技術從定性分析到定量分析的跨躍，同時這一技術具有敏感性強、特異性高、方便檢測和安全快速等優點，目前已廣泛應用於微生物生態學領域的研究中。

標準品製備

分別合成細菌、真菌和古菌特異性引物，引物序列如下：

表1. 引物序列

細菌、古菌和真菌qPCR分別採用從大腸桿菌DH5α中提取的細菌基因組DNA、紅冬孢酵母YM25235（選用其他代表性菌株也可以）提取的真菌基因組DNA作為模板，使用相應的引物擴增樣品中的目標片段（這一步擴增可以同時起到驗證引物特異性，探索PCR條件的作用），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切膠回收，把目的片段克隆到pMD?18-T載體上。

使用T4連接酶將純化後的目的片段與18-T在16°C過夜連接。然後10 μL連接產物加入100 μL感受態細胞中，冰浴30 min，42 °C熱激30 s，立即冰上放置15-20min，加600 μLLB培養基，37 °C200-250 rpm振蕩培養1小時，室溫下4000 rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400 μL上清液，用剩餘的培養基將細胞懸浮，將細菌塗布在預先用20 μL100 mM IPTG和100 ml20 mg/ml X-gal塗布的氨苄青黴素平板上，平板在37 °C下正向放置1小時以吸收過多的液體，然後倒置培養過夜，篩選陽性克隆並擴培。

圖1 標準品製備方法示意圖

標準曲線繪製

釆用生工質粒提取試劑盒提取質粒，通過分光光度計（Nanodrop, Germany）測定質粒DNA濃度，根據己知質粒濃度和阿伏伽德羅常數（6.02×1023）計算出每微升提取的質粒中靶基因的拷貝數，將質粒10倍稀釋後作為標準曲線的模板，90 μL稀釋液+10 μL質粒，做6個點，通過預實驗選取合適標準品用於製備標準曲線。

拷貝數的計算：

待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數

樣本分子量=鹼基數×324

待測樣本拷貝數（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6.02×1014

細菌和古菌16S rRNA基因及真菌的ITS基因的定量試劑為Takara公司的SYBR? Premix Ex Taq TM試劑盒。利用熒光染料SYBRGreen I在雙鏈DNA生成時嵌入到DNA分子內並發出可以檢測的熒光來進行定量。PCR反應在ABI 7500（Applied Biosystem，美國）熒光定量PCR儀上進行。

PCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，F引物0.4 μL，R引物0.4 μL，ROXDye 0.08 μL，DNA模板1 μL，H2O 8.12 μL；PCR反應程序：95°C預變性30 Sec；95°C變性5 Sec，60°C退火34 Sec（40個循環）。

在60°C延伸時檢測熒光信號，標準曲線每個濃度梯度做三次平行重複，同時設置陰性對照。以標準質粒模板起始拷貝數為橫坐標，熒光信號達設定閾值是所經歷的循環數Ct值為縱坐標，繪製標準曲線，擬合線性方程，例如：

本例根據下面式子，計算微生物數量：

擴增效率（E）計算使用下面的式子：

在我的實際例子中：細菌擴增效率為98.6%，R^2為0.989；古菌擴增效率為97.3%，R^2為0.983；真菌的擴增效率為99.1%，R^2為0.996。

樣品檢測

參照標準曲線構建方法對12個土樣DNA進行qPCR，每個土樣設三個平行，陰性對照模板以超純水替換。將檢測到的Ct值平均後代入相應的標準曲線推算初始拷貝數，最後以基因拷貝數每克干土為單位進行分析，如下圖。

今天的內容就到這裡啦，歡迎大家交流討論~

參考文獻

[1] Liu WT, Marsh TL, Cheng H,et al. Characterization of microbial diversity by determining terminalrestriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J].Appliedand Environmental Microbiology, 1997, 63(11): 4516-4522.

[2] Curlevski NJ, Xu Z, AndersoIC,et al.Soil fungal communities differ in native mixed forest and adjacent Araucaria cunninghamiiplantations in subtropical Australia [J].Journal of Soils and Sediments, 2010,10(7):1278-1288.

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