血液ctDNA-EGFR標準化檢測，三個關鍵環節全掌握

新聞 03-01

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非小細胞肺癌

導讀

非小細胞肺癌是最為常見的肺癌，占肺癌總數的80%，其治療前需檢測EGFR基因突變已成共識。這篇文章主要為大家介紹非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測的三個重要環節——標本採集及處理、cfDNA的提取、EGFR突變檢測。

非小細胞肺癌（NSCLC）中EGFR基因突變狀態與EGFR酪氨酸激酶抑製劑（EGFR-TKIs）療效預測的相關性早已被證實，NSCLC治療前需檢測EGFR基因突變也已成共識。但是在臨床實踐中，首先，多數肺癌患者確診時往往已到晚期，其中相當部分腫瘤組織標本難以獲取，導致無法進行EGFR檢測；另外，部分患者腫瘤內EGFR基因突變的異質性使基於基因檢測的靶向治療決策變得更加困難；最後，我國的EGFR基因突變檢測在肺癌患者中的受檢率相對偏低，吉林腫瘤醫院程穎教授在2017 WCLC會議報告上指出：相對於歐美接近100%的檢測率，中國北方三級甲等和腫瘤醫院中，肺癌的EGFR檢測率也僅僅只有46%。因此，針對臨床實踐中腫瘤組織檢測的種種局限，探尋作為其補充或替代的其他生物標本進行EGFR基因檢測具有重要臨床意義，也有助於提高臨床患者的總體EGFR基因受檢率。

近些年，以血液等為樣本基礎的液體活檢技術飛速發展。多項研究表明[1-3]，大部分晚期NSCLC患者的血液中存在循環遊離DNA（cfDNA）及循環腫瘤DNA（ctDNA）；並且已有研究顯示外周血ctDNA EGFR基因突變檢測結果對EGFR-TKIs療效有預測作用[2，4-5]。因此，當腫瘤組織難以獲取時，無創、易採集的血液檢測就是組織EGFR基因突變分析合適的替代選擇，並且血液檢測在一定程度上能有效克服腫瘤異質性，可實現無創實時動態檢測等。

標準化的檢測流程是保障ctDNA-EGFR血液檢測質量的前提，臨床專家對於血液檢測應用規範問題也多有探討，並於2015年12月8號在《中華醫學雜誌》上發表了由吳一龍、王潔等教授整理的《非小細胞肺癌血液EGFR基因檢測中國專家共識》。其中，標本採集及處理、cfDNA的提取、EGFR突變檢測是血液檢測的三個重要環節。

一、血液EGFR基因突變檢測之標本採集及處理

患者選擇

研究顯示，腫瘤分期越高，ctDNA檢出率越高[6]，即III或IV期的腫瘤患者血液中的ctDNA相較Ⅰ/Ⅱ期的患者含量更高，更容易被檢出。因此，為提高血液EGFR檢出率，建議選擇晚期患者。

須知藥物治療過程中，EGFR突變情況以及ctDNA的濃度可能發生變化。如下圖所示[7]：

標本採集及分離

全血中血漿和血清均能分離出ctDNA，但研究顯示，相對於血清標本，血漿中ctDNA有更高的檢出率[8]。另外，對同一患者，血漿量越多所提取的DNA量就越多，其中含有的cfDNA量就越多，對檢測越有利[9]，如下圖所示：

因此按照專家共識[10]建議採集10ml全血（可分離4-5ml血漿），採集完成後需溫柔顛倒混勻，以便於抗凝劑或保護劑充分與血液接觸。

此時需根據使用的采血管類型（常規EDTA抗凝管/專用常溫采血管）進行不同的後續操作。

（1）：用常規EDTA抗凝管採集全血後，為防止遊離DNA的降解，避免野生型DNA背景的增加，建議兩小時內以足夠的離心力將全血充分低溫離心兩次[11]，分離出不含細胞成分的血漿，吸取操作如下圖所示，分離出的血漿放置於-70℃凍存直至DNA抽提，或直接進入DNA抽提步驟（備註：離心前臨時保存應暫放於2~8℃冷藏）；

（2）：用含有遊離DNA保護劑及防細胞裂解保護劑的專用常溫采血管採集後輕搖混勻，常溫放置不超過5-7天，以足夠的離心力將全血充分離心兩次，分離出不含細胞成分的血漿，放置於-70℃凍存直至DNA抽提，或直接進入DNA抽提步驟。如果外送運輸全血，建議使用cfDNA專用常溫采血管。

禁用肝素抗凝管：由於肝素使得DNA抽提得率降低並在DNA提取過程中難以去除，肝素也會導致PCR效率降低，因此cfDNA檢測血液採集禁用肝素抗凝管。

血漿質量評價

（1）血漿是否溶血：如發生嚴重溶血，標本不可用，血紅蛋白及其代謝產物可能抑制Taq酶活性，使PCR擴增效率明顯降低。

（2）血脂是否過高：血脂過高，使血漿呈乳白色，低密度脂蛋白對熒光有屏蔽和吸收作用，故對PCR有干擾。

二、血液EGFR基因突變檢測之cfDNA提取

10ml全血分離出的4-5ml血漿用於cfDNA的提取，目前可用於cfDNA提取的方法很多，有實驗室自建方法，也有商用核酸提取試劑盒。建議採用國家葯監部門批准的、大容量血漿遊離DNA分離試劑盒。

所提取的cfDNA建議馬上使用，若不能立即進行後續檢測而需要儲存cfDNA，首選-80℃冰箱凍存。若無-80℃冰箱，可選擇-20℃保存，應儘可能縮短凍存時間，儘快進行後續檢測。凍存時注意密封及標記完整，避免反覆凍融。

三、血液EGFR基因突變檢測

中國國家食品藥品監督管理總局（CFDA）在2015年2月批准吉非替尼說明書更新，可通過血液ctDNA檢測EGFR基因突變指導吉非替尼治療。近期，CFDA更是通過創新醫療器械特別審批的方式，快速批准艾德生物自主創新產品Super-ARMS EGFR檢測試劑盒（Super-ARMS技術是在原有ADx-ARMS技術優勢基礎上，優化引物探針設計和反應體系，將檢測靈敏度提升至0.2%，完全適用於對靈敏度要求更高的血液檢測領域）用於血液ctDNA-EGFR基因突變的檢測。由此可見，ctDNA-EGFR標準化檢測的時代已經到來！

為了降低假陽性概率，推薦使用經國家葯監部門批准的高敏感度的檢測方法用於ctDNA樣本的EGFR基因突變檢測。專家共識中也指出，檢測必須在具有資質的檢測中心進行。檢測方法必須進行嚴格的驗證及質控。檢測試劑須使用經CFDA批准的檢測試劑盒。目前，檢測基因突變最常用的方法是擴增阻遏突變系統(ARMS法)，歐盟批准用於指導吉非替尼治療的血液檢測方法也是ARMS檢測方法。而Super-ARMS方法是CFDA批准用於血漿中EGFR突變檢測的敏感度最高的ARMS方法，其檢測靈敏度可達0.2%。

根據今年ESMO（歐洲臨床腫瘤協會年會）大會上，上海肺科醫院周彩存教授、廣東省人民醫院吳一龍教授等多位肺癌權威專家共同發布的AURA 17擴展研究數據可知[12]，Super-ARMS 技術檢測血漿T790M突變的陽性檢出率僅次於目前靈敏度最高的ddPCR技術，更重要的是，Super-ARMS技術檢出的血液T790M突變陽性患者服務奧希替尼的客觀響應率（ORR）最高，高達64%，說明靈敏度0.2%的Super-ARMS技術是臨床血液ctDNA檢測的最優選擇，療效預測的準確性最高，是血液檢測臨床應用的可靠技術。

總之，血液EGFR突變檢測的標準化、合規化是保證檢測準確率的核心，在減少操作流程對檢測結果影響的前提下，選擇經國家葯監部門嚴格審批上市的檢測產品和合規專業的檢測機構也是至關重要的。

參考文獻：

1、 Goto K, Ichinose Y, Ohe Y, et al., Epidermal growth factor receptor mutation status in circulating free DNA in serum: from IPASS, a phase III study of gefitinib or carboplatin/paclitaxel in non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2012, 7(1):115-121.

2、 Karachaliou N, Mayo-de las casas C, Queralt C, et al., Association of EGFR L858R Mutation in Circulating Free DNA With Survival in the EURTAC Trial[J]. JAMA Oncol, 2015,1(2):149-157.

3、 Yung TK, Chan KC,Mok TS,et al., Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital PCR in non-small cell lung cancer patients[J].Clin Cancer Res,2009,15(6):2076-2084.

4、 Bai H, Mao L,Wang HS,et al., Epidermal growth factor receptor mutations in plasma DNA samples predict tumor response in Chinese patients with stages IIIB to IV non-small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2009,27(16):2653-2659.

5、 Kimura H,Kasahara K,Kawaishi M,et al., Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(13):3915-3921.

6、 Bettegowda C,Sausen M,J. Leary R,et al., Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies[J].Sci Transl Med,2014, 6(224):224-247.

7、 Zheng D,Ye X, Zhang MZ, Y. Sun, et al., Plasma EGFR T790M ctDNA status is associated with clinical outcome in advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance[J].Sci Rep.2016,6:20913-20921.

8、 Vallée A, Marcq M,Bizieux A, et al.,Plasma is a better source of tumor-derived circulating cell-free DNA than serum for the detection of EGFR alterations in lung tumor patients[J].Lung Cancer,2013,82(2):373-374.

9、 Sherwood JL,Corcoran C,Brown H, et al., Optimised Pre-Analytical Methods Improve KRAS Mutation Detection in Circulating Tumour DNA (ctDNA) from Patients with Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)[J]. . PLoS ONE 11(2): e0150197.

10、非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識，中華醫學雜誌，2015,95（46）：3721-3725.

11、 EI Messaoudi S,Rolet F, Mouliere F,et al., Circulating cell free DNA: Preanalytical considerations[J].Clin Chim Acta,2013,424:222-230.

12、 AURA 17 , ESMO 2017.

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