聚合酶鏈式反應

PCR 技術應用領域

1. 檢驗感染性疾病是否處於隱性或亞臨床狀態；

2. 有效檢測癌基因的突變，準確檢測癌基因的表達量；

3. 臨床應用於檢測地中海貧血的基因突變。

實驗原理

PCR 技術的基本原理類似於 DNA 的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR 由變性 -- 退火 -- 延伸三個基本反應步驟構成：

模板 DNA 的變性：模板 DNA 經加熱至 94 ℃ 左右一定時間後，使模板 DNA 雙鏈或經 PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；

模板 DNA 與引物的退火 (復性)：模板 DNA 經加熱變性成單鏈後，溫度降至 55 ℃ 左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結合；

引物的延伸：DNA 模板 -- 引物結合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留複製鏈。

重複循環變性 -- 退火 -- 延伸三過程，就可獲得更多的「半保留複製鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4 分鐘， 2～3 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

常見問題及對策

假陰性，不出現擴增條帶

1. 模板原因

模板中含有雜蛋白質。

模板中含有 Taq 酶抑製劑。

模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白。

2. 酶失活

需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。

忘加 Taq 酶或溴乙錠。

3. 引物

引物質量。

引物的濃度。

兩條引物的濃度是否對稱。

解決對策

選定一個好的引物合成單位。

引物的濃度不僅要看 OD 值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做 PCR 有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。

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