基因科技最新技術進展

東南大學開發出一種新的滾環擴增技術（生物通）

東南大學生物電子學國家重點實驗室的研究團隊近日在《BioTechniques》雜誌上介紹了一種使用新的莖環引物的滾環擴增技術。這項技術能夠克服現有的滾環擴增技術的局限，在液相或固相中實現特異而靈敏的目標DNA檢測。

滾環擴增（RCA）技術是一種常用的等溫核酸擴增技術，利用環狀模板和特殊的DNA聚合酶（比如Phi29）實現目標擴增。這種技術可分為線性RCA（lRCA）和指數RCA（eRCA）兩種形式。線性RCA使用單個引物，只適用於環狀模板的擴增。

為了提高RCA檢測的靈敏度，人們開發出各種RCA方法，包括eRCA。最早的eRCA方法使用多重引物，然而，這種方法的擴增效率往往受制於模板的長度和引物的數量。之後，人們又開發出超分支滾環擴增（hbRCA），它依賴與IRCA擴增產物互補的一個或多個引物，具有出色的靈敏度。

此外，RCA檢測也分為固相和液相兩種。液相RCA通常是由hbRCA實現的，不過目前難以實現均質的檢測。固相RCA則大多依賴IRCA，優點是可以同時檢測多個靶標，並輕鬆分離RCA產物。不過，固相IRCA檢測的靈敏度較低，過程較繁瑣。

於是，研究人員開發出一種新的RCA技術，它利用莖環引物（SLP），可以在lRCA和eRCA中檢測目標核酸。SLP-lRCA檢測只使用一個引物（SLP1），其莖環序列與目標分子特異的。SLP-eRCA檢測則使用兩個引物（SLP1和SLP2）。

對於固相檢測，SLP-eRCA分四步檢測核酸：1) 將捕獲探針（CP）固定在固相支持物上；2) 將DNA樣品與CP晶元雜交；3) 將CP晶元與含有兩個SLP的RCA反應孵育；4) 對CP晶元進行成像。對於液相檢測，SLP-eRCA可實現核酸的一步檢測。

作者認為，這項研究為新的RCA核酸檢測技術提供了概念證明，說明它能夠克服現有RCA方法的主要局限，實現特異而靈敏的目標DNA檢測。

CRISPR再迎技術革新！xCas9可有效提高CRISPR效用！（轉化醫學網）

哈佛大學的化學生物學家David Liu領導的研究團隊設計出一種稱為xCas9新酶，可更多更有效地修改基因組中的位點，進而提高CRISPR-Cas9的效用，同時還可降低脫靶風險。這項研究結果以《Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity》為題發表在2月28日的《Nature》上。

CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的鹼基配對能力，另一部分是Cas9蛋白對靶DNA的3"末端發現的被稱為protospacer adjacent motif（PAM）的DNA序列上的識別能力。

PAM通常由NGG三個鹼基構成（N為任意鹼基）。

病毒入侵時，Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描這段外源DNA，並識別出PAM區域，然後將臨近PAM的DNA序列作為候選的原間隔序列。

隨後，Cas1/2蛋白複合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，並在其他酶的協助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導區的下游。不同的Cas9的識別能力不同。

目前，最常用的實驗Cas9是從化膿性鏈球菌中分離而來，稱為spCas9，其在具有32億個鹼基對的人基因組中，大約僅能正確識別其中的1/16序列。這就是CRISPR-Cas9技術的真正局限性。

Liu及其研究團隊對spCas9稍加改動，迫使spCas9在實驗室中迅速擴增，積累突變，再識別各種PAM序列並對臨近的DNA進行切割。他們最終獲得了xCas9，其可更廣泛地識別不同的PAM，從而使得Cas9的識別能力增加了至少4倍。

研究人員對該酶進行了測試，並將其與鹼基編輯器組合，他們發現，改變後的xCas9的不僅提高了CRISPR-Cas9的效用，而且切割能力未受影響，甚至降低了脫靶風險，成功實現了雙贏。

連續進化的Cas9具有更寬的PAM兼容性

演變後的xCas9在人細胞中的轉錄激活和基因組DNA切割

另一方面，加利福尼亞大學聖地亞哥分校的生物工程師Prashant Mali說，同樣的方法可以用來改變Cas9酶的其他變體，包括一些有希望用於基因治療的相對較小的Cas9蛋白質。他說，那些蛋白質往往具有更為嚴格的限制性PAM序列，若能成功應用這項技術，對基因治療將是莫大福音！

加利福尼亞斯坦福大學的合成生物學家 Stanley Qi 稱這項工作「令人眼花繚亂」，並表示他的團隊渴望在實驗中應用此項成果。xCas9具有更廣泛的PAM識別和更高的特異性，這足夠令科學家們興奮，但是，在徹底挖掘出這項技術的潛力前，仍需要進行更多的測試。

喬傑院士團隊發表人體外成熟卵母細胞單細胞測序最新成果（BIOART）

2月27日，北京大學第三醫院喬傑院士團隊的李蓉教授、于洋副研究員與廣州醫科大學附屬第三醫院范勇教授，昆明理工大學譚韜副教授團隊合作，在Antioxidants & Redox Signaling雜誌在線發表題為「Single-cell transcriptomics of human oocytes: environment-driven metabolic competition and compensatory mechanisms during oocyte maturation」的研究成果，揭示了體外培養影響人卵母細胞成熟及發育潛能的關鍵分子及其作用機制。

在該研究中，研究者在倫理委員會指導下，通過來自於3名女性捐贈的6枚卵母細胞（每名女性捐贈1枚成熟與1枚不成熟卵母細胞），利用單細胞轉錄組測序技術，從整體水平上，對體外成熟卵母細胞中的RNA表達特徵進行了闡述，並利用小鼠模型、幹細胞模型、人類樣本等，從基因、亞細胞結構、細胞發育等不同層面，系統揭示了代謝通路關鍵分子ACAT/HADHA-DPYD在維持卵母細胞發育潛能方面扮演重要的角色。

首先，研究者利用高通量測序與生物信息學分析手段，明確代謝通路的改變是體外成熟卵母細胞與體內成熟卵母細胞的最典型差異。進而，通過多種篩選手段，包括與不同質量的體內成熟卵母細胞比較、物種間比較等，明確三種與輔酶A相關的酶編碼基因（ACAT1、HADHA、DPYD）是潛在影響體外成熟卵母細胞發育潛能的靶標分子（下圖）。

篩選與人體外成熟卵母細胞發育潛能相關的靶標分子

其中，ACAT1和HADHA協同調控三羧酸循環的底物乙醯輔酶A與琥珀酸的生成，間接影響三羧酸循環的效率，導致線粒體功能不足。同時發現，三羧酸循環酶類的激活劑鈣離子在體外成熟卵母細胞中濃度降低，再次提供證據表明體外成熟卵母細胞線粒體功能及能量代謝異常。

然而，為維持發育的進行，卵母細胞在鈣離子攝入障礙的情況下，內源鈣離子釋放，實現鈣離子濃度代償。同時，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸轉氫酶（NNT）編碼基因上千倍上調錶達，促進體內NADH與NADP+的生成。一方面NADH可以提供額外的能量供卵母細胞成熟發育，緩解線粒體功能失調導致的NADH生成減弱，維持其細胞質的生物學功能；另外一方面，NADP+的生成上調DPYD表達，對體外成熟卵母細胞中出現的異常DNA雙鏈斷裂進行修復，維持其細胞核的生物學功能。

綜上所述，研究者首次利用嚴格的對照，排除不同人群遺傳的潛在影響，從組學篩選到靶標分子的生物學功能鑒定的系列實驗中，明確人體外成熟卵母細胞從受損到功能代償的分子機制。研究在提示輔助生殖技術每一步操作都潛在對生殖細胞產生影響的同時，也為輔助生殖技術的持續優化提供了理論基礎。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！