1330期-2：會議2018基因編輯學術研討會即將在京召開
小桔燈網微信號:ivdnet.
基因組編輯技術CRISPR/Cas9自2013年被《科學》列為年度十大科技進展之一後，始終保持高速發展，在Google學術上，CRISPR/Cas9相關的文獻已經超過51700篇。為集中展示國際前沿及國內前沿的基因編輯技術，3月30~31日，由北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室主辦的2018基因編輯學術研討會將在京舉行。
過去的一年中，基因編輯領域繼續保持高速發展，比如：可以終止基因編輯過程的蛋白質被發現；操縱Cas9的REC3結構域可大幅降低CRISPR-Cas9的脫靶效應；CRISPR基因編輯結合離體器官構建技術可以幫助檢測遺傳性癌症特異性DNA缺陷；CRISPR裝備噬菌體可以讓「超級細菌」自殺等。
2018基因編輯學術研討會將涉及多基因、大片斷基因編輯，單鹼基編輯, 在RNA水平進行修復的「REPAIR」系統，基因編輯抑製劑與CRISPR/Cas9的配合，如何降低CRISPR/Cas9的脫靶效應，不依賴於DNA雙鏈斷裂的新型腺嘌呤鹼基編輯器，利用CRISPR/Cas9技術開發新型藥物篩選工具等主題，眾多一線科研工作者將聚集於此共襄學術盛宴。
大會日程
部分會議報告摘要一覽
王皓毅 中國科學院動物研究所
CRISPR-Cas9在動物模型構建、T細胞治療以及基因表達調控中的應用
高效精確的基因工程技術對於發展基因治療，建立細胞和動物疾病模型具有極為重要的價值。近年來特異性定點核酸酶的研究取得了長足的進步。為了突破傳統基因打靶方法的局限，我們率先通過受精卵注射CRISPR-Cas9一步獲得多基因敲除的小鼠。為了取代低通量且技術要求極高的顯微注射技術，我們建立了受精卵電擊的方法，從而極大簡化了動物模型的構建。這一系列工作大大提高了基因修飾小鼠構建效的率和速度，為疾病和發育生物學的體內研究提供了重要的工具。同時我們在原代T細胞和表達嵌合性抗原受體的T細胞（CART）中建立了高效的單基因和多基因敲除技術，為細胞免疫治療研究提供了工具。除了基因編輯，我們也基於CRISPR-Cas9系統建立了新技術，用來調控基因的表達水平和表觀遺傳修飾狀態。
王艷麗 中國科學院生物物理研究所
Cas13a 切割RNA的分子機制
CRISPR/Cas系統是原核生物抗免疫防禦系統，是近年來發現的由小分子RNA介導的免疫系統。CRISPR-Cas系統分為兩大類，Cas13a是第二大類VI型系統中的效應蛋白，亦稱C2c2，具有RNA介導的RNA酶切活性，是目前第二大類CRISPR-Cas系統發現的唯一能夠降解RNA的蛋白，在RNA技術中具有潛在的應用價值，對開發研究RNA工具，擴展CRISPR系統在基因編輯方面的運用具有重大價值。
為了研究Cas13a如何被激活來切割RNA，我們解析了與crRNA及其靶RNA結合的Leptotrichia buccalis（Lbu）Cas13a的晶體結構，以及LbuCas13a-crRNA複合物的cryo-EM結構。研究結果揭示了crRNA-靶RNA雙鏈體結合在核酸酶（NUC）葉片的帶正電的中心通道中，並且Cas13a蛋白和crRNA在靶RNA結合後發生顯著的構象變化。指導目標RNA雙鏈體形成觸發HEPN1結構域向HEPN2結構域移動，激活Cas13a蛋白的HEPN催化位點，其隨後以非特異性方式裂解單鏈靶標和旁系RNA。
研究結果證實target RNA的結合導致LbuCas13a的兩個HEPN結構域發生構象變化，從而激發LbuCas13a非特異性地切割任意單鏈RNA的酶切活性，該成果為研究Cas13a發揮RNA酶活性的分子機制提供了重要的結構生物學基礎。該研究的發現為CRISPR-Cas13a系統的進一步開發提供了可靠的結構基礎，對深入理解細菌抵禦病毒入侵的分子機制提供了強有力的證據，並將對病毒引起的疾病的預防、檢測、控制與治療產生重大意義，特別是基於Cas13a高效的RNA酶切活性，對其應用於各類重大疾病的快速檢測具有十分廣闊的前景。
吳強 上海交通大學
開發DNA大片段編輯技術研究染色質高級結構
源於細菌和古菌的Ⅱ型成簇規律間隔短迴文重複系統[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9]近年被改造成為基因組定點編輯的新技術。由於它具有設計簡單、操作方便、費用低廉等巨大優勢，給遺傳操作領域帶來了一場革命性的改變。基於CRISPR/Cas9系統的基因組DNA片段靶向編輯技術主要包括DNA片段的刪除、反轉、重複、插入和易位等，這一有效的DNA片段編輯方法為研究基因功能、調控元件、組織發育和疾病發生髮展提供了有力手段。我將著重彙報我們在該領域最新的研究CTCF等染色質架構蛋白在三維基因組組裝調控的進展，為開展利用基因組DNA片段靶向編輯進行基因調控和功能研究提供參考。
周德敏 北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室
Manipulation of Viral Genome in Conversion of Life-Threatening Viruses as Precision Therapeutics
The conversion of life-threatening viruses into live but avirulent vaccines represents a revolution in vaccinology. In a proof-of-principle study, we expanded the genetic code of the genome of influenza A virus via a transgenic cell line containing orthogonal translation machinery. This generated premature termination codon (PTC)–harboring viruses that exerted full infectivity but were replication-incompetent in conventional cells. Genome-wide optimization of the sites for incorporation of multiple PTCs resulted in highly reproductive and genetically stable progeny viruses in transgenic cells. In mouse, ferret, and guinea pig models, vaccination with PTC viruses elicited robust humoral, mucosal, and T cell–mediated immunity against antigenically distinct influenza viruses and even neutralized existing infecting strains. The methods presented here may become a general approach for generating live virus vaccines that can be adapted to almost any virus.
王永明 復旦大學
建立高效的CRISPR/Cas9編輯技術
CRISPR/Cas9是一項革命性的基因編輯技術，得到廣泛應用。我們從兩個方面著手提高CRISPR/Cas9的編輯效率。我們利用附著體載體表達Cas9和gRNA，稱之為epiCRISPR技術。附著體載體不整合到基因組，但是可以隨著細胞的分裂而複製，因而可以長期的表達外源基因，實現長期的基因編輯。同時在附著體載體上表達嘌呤黴素抗性基因，可以富集轉染成功的細胞。編輯完成後撤除篩選藥物，附著體質粒迅速丟失，編輯後的細胞不再表達外源基因。利用附著體技術可以實現高達100%編輯效率，還可以高效的敲除基因組大片段，以及同時敲除多個基因。CRISPR/Cas9編輯效率受gRNA序列影響，不同的gRNA效率差別很大，測試gRNA效率費時費力。我們建立了高通量的測試gRNA活性的方法，得到了5萬多條gRNA的活性，覆蓋了2萬多個人類基因。這些工作將會極大的方便基因編輯工作。
常興 中國科學院上海生命科學研究院
利用靶向性胞嘧啶脫氨酶進行基因編輯
單核苷酸的多樣性是遺傳多樣性的主要來源，是人類個體差異的重要遺傳學基礎，同時也是分子進化的動力和很多疾病的直接誘因。然而，在哺乳動物中，仍然缺乏有效誘導單核苷酸的突變的工具，無法通過實驗高效和高通量的地研究單核苷酸突變的功能。現有的大部分實驗技術只能擾亂基因的功能或者表達，造成基因功能缺失，對誘導新功能的獲得無能為力。而利用靶向性胞嘧啶脫氨酶介導的鹼基編輯（Targeted AID-mediated mutagenesis ,TAM）技術，可以在sgRNA靶向的基因組DNA上，將胞嘧啶和鳥嘌呤隨機地向其它三個鹼基轉變，因而產生海量的突變體，結合遺傳篩選，從而分析單核苷酸突變的功能或誘導蛋白質的體內進化。同時在一種多肽抑製劑（UGI）的輔助下，dCas9-AID可以誘導特定的胞嘧啶向胸腺嘧啶轉變，實現單鹼基的精確編輯，為治療單核苷酸突變誘導的遺傳病提供方案。利用這項技術，已經在慢性骨髓瘤細胞中，成功篩選出已報道的以及新的imatinib耐藥性位點。因此，作為高效的哺乳動物DNA鹼基編輯新技術，TAM可以廣泛應用於蛋白質工程，分子遺傳學研究和基因治療等領域。
朱潔廣州市婦女兒童醫療中心
CRISPR-Cas9介導的光感受器細胞重編程治療視網膜色素變性
基因治療已經在多種人類疾病治療中顯示出巨大的潛能。然而目前的方法通常只針對單個基因或單個突變，使得對多基因或多點突變的疾病治療受到極大限制。視網膜色素變性是臨床常見的致盲眼病，極具臨床和遺傳異質性，是導致人類視力障礙最主要的疾病之一。目前已有超過40個基因和位點被報道與視網膜色素變性有關。這裡我們採用CRISPR/Cas9介導的基因編輯方法，對視網膜色素變性小鼠進行了基因治療。通過突變視桿細胞中重要的轉錄因子Nrl或Nr2e3，將視桿細胞重編程為視錐細胞。轉化後的視錐樣細胞對突變引起的感光細胞退化不敏感，從而使小鼠在發病後期仍能保留一定程度的視力。我們的發現不僅為視網膜色素變性提供了新的不依賴於基因突變的治療方法，而且證明了基因編輯技術介導的細胞重編程、細胞退化預防以及組織功能保護的巨大可能性。
楊輝，中科院上海神經所
基因編輯在疾病模型建立及疾病治療中的應用
基因修飾動物是研究在發育和疾病中基因功能的重要工具。CRISPR/Cas9系統有效的應用於構建基因敲除和敲入小鼠。然而，該方法獲得的基因修飾動物存在嚴重的嵌合體現象，即動物個體的一部分細胞被基因編輯，而另一部分則沒有。通過交配方法獲得純合的基因敲除小鼠需要很長的時間和花費，這在獲得多基因敲除小鼠中尤為明顯。而由於猴子的生殖周期長（4-5年性成熟，半年懷孕期），生殖能力低（單胎動物），通過交配方法來獲得純合突變的基因修飾猴則需要更長的時間和花費。為此，我們通過優化CRISPR/Cas9系統，成功的在第一代就獲得了單基因或多基因功能完全敲除的小鼠及猴，可以直接用於表型分析，極大促進了非人靈長類動物模型的建立及其在腦科學及腦疾病中的研究。同時我們設計了一種同源介導末端接合（HMEJ）策略，可以在分裂和非分裂細胞中均實現精確且高效的基因整合。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎或者體內的肝細胞和神經元中，該方法的效率均遠高於以HR、NHEJ和MMEJ為基礎的策略。因此，這種HMEJ策略可能具有多種運用性，譬如基因編輯來獲得動物模型以及靶向基因治療。
通過上述幾種方法，我們可以有效的在猴中獲得各種基因修飾猴模型。近期，我們目標獲得的疾病猴模型包括PD，AD，ALS，DMD，RP，AS等，工具猴模型包括光遺傳猴，各種神經元特異的Cre猴等。這些猴模型的建立將極大促進我們對人類疾病的了解和治癒。
此外，我們也致力於各種CRISPR相關工具的開發及優化，包括CRISPR激活系統，CRISPR標記系統，CRISPR介導的成體治療等等。
馬燕琳海南醫學院第一附屬醫院
基因編輯與生殖健康
基因編輯技術通過插入、缺失或替換的手段對基因組進行定點改造，既能夠通過以突變基因代替正常基因來研究基因的功能，也能夠以正常基因代替突變基因來進行基因治療。近年來，有著「基因剪刀」之稱的CRISPR/Cas9技術被認為是能夠在活細胞中快速、準確地編輯目的基因的有效方法。隨著人類在破譯基因的遺傳密碼和基因編輯技術上的不斷突破，通過修改基因從根本上治癒和預防疾病成為可能，特別是在單基因疾病的治療上，基因編輯有著廣闊的運用前景。就生殖健康方面而言，卵巢早衰這類由表觀遺傳引起的疾病目前只能通過替代治療延緩癥狀，不能根治。CRISPR/Cas9技術的出現有望對錶觀遺傳的靶點進行遺傳編輯，改善生殖健康，也為生殖相關疾病提供了新的治療思路。此外，利用基因編輯對胚胎特定基因集進行敲除操作，造成相應基因在胚胎中的缺失，可深入研究人類胚胎早期發育中的功能、作用機理，幫助人類了解生物體的基本功能，也可以推動人類健康事業的發展,從根源上清除遺傳疾病。
張淑君 華中農業大學
建立和利用豬全基因組基因敲除CRISPR/Cas9技術篩選鑒定豬流感病毒感染相關的宿主（豬）基因
在豬PK15細胞系中，證實了CRISPR/Cas9系統在豬細胞系中能高效地誘導豬基因敲除。設計和構建了豬全基因組基因敲除CRISPR/Cas9文庫，該文庫包含了65316個gRNAs、覆蓋了13229個基因，其中含有5個gRNAs的基因有11400個基因、含有4個gRNAs的基因有1829個，並且全部的基因都含有至少2個gRNAs（最多不超過5個gRNAs/基因）。利用該豬全基因組基因突變gRNAs文庫進行大規模的基因篩選，初步篩選出了140個候選宿主基因，並證實了其中的32個候選基因在病毒複製增殖中具有一定的調控作用
周峰 復旦大學生物醫學研究院
TAG:小桔燈網 |