過去的理論又錯了，兩篇研究長文報道CTLA-4抗體在腫瘤免疫治療中的新機制新模型

本文轉載自「BioArt」。

這兩項研究表明，長久以來流行的抗CTLA-4抗體Ipilimumab在癌症免疫治療中的免疫檢查點假說並不成立，即Ipilimumab並沒有通過阻斷CTLA-4/B7相互作用而發揮抗腫瘤效果，而清除Fc受體介導的高表達CTLA-4的腫瘤局部調節性T細胞（Treg）則在有效的免疫治療中至關重要。作者利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型，模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯用造成的各個臟器的免疫副作用，並評估了其它抗CTLA-4抗體的安全性，闡明了失調的自身反應性Treg及全身T細胞的活化是造成免疫副作用的根本原因。這些研究成果對今後研發新一代高效並且安全的抗CTLA-4抗體以及其它以CTLA-4為靶點的藥物有著深遠的指導意義。

近年來，隨著腫瘤免疫調控機制的逐漸清晰和基因改造技術的不斷提高，腫瘤免疫治療領域得到了空前發展。尤其是近幾年來，免疫檢查點 （Immune Checkpoint）單抗藥物與嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞免疫治療的效果逐漸獲得認可，癌症免疫治療的概念也越來越深入人心。目前腫瘤免疫藥物治療的最主要方面是腫瘤免疫檢查點抑製劑，即通過抑制腫瘤細胞的免疫逃逸，調動自身免疫系統功能來消除腫瘤，當前的研究主要集中在CTLA-4、PD-1和PD-L1三個分子上。

CTLA-4分子高表達於調節性T淋巴細胞（Treg）和激活的T淋巴細胞上。正常情況下，T淋巴細胞的活化需要兩條信號通路共同激活，其一是T細胞受體（TCR）與抗原呈遞細胞（APC）呈遞的MHC-抗原肽複合物相結合（信號1），其二是B7分子（B7-1或B7-2）與T細胞表面的共刺激分子CD28相結合（信號2）。T細胞活化後高表達的CTLA-4分子雖然與CD28具有高度同源性，但功能相反，即CTLA-4分子與B7分子結合後抑制T細胞的活化。

2011年，美國FDA批准首款抗CTLA-4抗體抑製劑Ipilimumab（商品名YERVOY?）用於黑色素瘤的治療，療效顯著。根據免疫檢查點阻斷的假說（Checkpoint Blockade Hypothesis），在外周淋巴器官，抗CTLA-4抗體如Ipilimumab是主要通過阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號通路【圖1】，從而促進T細胞的激活而發揮抗腫瘤作用。然而這一流行的關於Ipilimumab在癌症免疫治療中發揮作用的主要假說並沒有得到嚴格的實驗驗證。

圖1. T細胞的活化需要通過TCR/MHC（信號1）和CD28/B7（信號2）進行共刺激。 抗原呈遞細胞（APC）上的B7分子（包括B7-1和B7-2）與T細胞上的CTLA-4的結合抑制T細胞功能。 抗CTLA-4抗體阻斷CTLA-4結合B7並阻止其對T細胞功能的抑制。

雖然Ipilimumab可以阻斷錨定狀態的（Immobilized ）CTLA-4分子和遊離的（Soluble ）B7分子的相互作用【圖2A】（J Immunol. 2003 Dec 1;171(11):6251-9.），但B7分子是膜表面表達的共刺激分子，因此以前的研究並不能證實Ipilimumab能夠有效阻斷在生理狀態下的CTLA-4和B7的相互作用。劉陽/鄭盼教授聯合實驗室的研究表明，當B7分子被固定後（比如B7包被在ELISA板上時【圖2B】或者表達在細胞表面【圖2C】），Ipilimumab（包括臨床上使用的Ipilimumab以及按照已公布的抗體序列由不同公司合成的Ipilimumab）在體外並不能很好地阻斷細胞表面的CTLA-4/B7的相互作用【圖2D】，也不能有效地阻斷CTLA-4介導的B7分子的轉胞吞（Transendocytosis）作用【圖2E】。與此不同的是，劉陽/鄭盼教授聯合實驗室篩選出的另外一種抗CTLA-4的半人源化的抗體L3D10 （Blood. 2005 Feb 1;105(3):1114-20.和Blood. 2005 Nov 1;106(9):3127-33.），卻能非常顯著地阻斷各種形式的CTLA-4/B7的體外相互作用【圖2】。 此外，在human CTLA-4 knock-in的人源化小鼠和human CD34+ stem cells重組的NSG小鼠中，L3D10——而不是Ipilimumab——能夠顯著抑制human CTLA-4對脾臟樹突狀細胞表面B7分子的轉胞吞下調【圖2F】，從而提供了在體內實驗中的生理狀態下Ipilimumab不能有效阻斷CTLA-4/B7相互作用的證據。

圖2. 當B7分子被固定時，L3D10——而不是Ipilimumab——能夠在體外和體內顯著阻斷CTLA-4/B7的相互作用。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）

更重要的是，劉陽/鄭盼教授聯合實驗室的研究指出，阻斷CTLA-4/B7的相互作用，並沒有貢獻於抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果。這一論斷來自多個方面的實驗證據：

1）在human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h，即CTLA4的兩個等位基因均來自human）的小鼠模型中，抗human CTLA-4的抗體L3D10能夠有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用；而在human CTLA-4半人源化（CTLA4h/m，即CTLA4的兩個等位基因一個來自human，一個來自mouse）的小鼠模型中，只能識別human CTLA-4的L3D10不能有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用。儘管如此，在CTLA-4全人源化和半人源化的小鼠模型中，L3D10和Ipilimumab都能有效的消除MC38腫瘤【圖3A、圖3B】和減緩B16腫瘤的生長。

2）將半人源化的L3D10進行完全人源化後篩選得到的兩株失去阻斷CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗體【圖3C】，並沒有影響其抗腫瘤的作用，因為HL12和HL32展現出與Ipilimumab一樣的抗腫瘤效果【圖3D】。

3）用B7分子的阻斷性抗體1G10/GL1處理實驗小鼠，在事先阻斷B7功能的情況下，Ipilimumab仍能發揮有效的抗腫瘤作用，進一步說明其並不依賴於阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號通路【圖3E】。

4）三種常見的抗mouse CTLA-4抗體（4F10/9D9/9H10），它們阻斷CTLA-4/B7相互作用的能力差別很大（如9D9和L3D10一樣具強阻斷能力，而9H10則不顯示或者具備非常弱的阻斷能力）。然而，文獻報道它們都具備非常好的抗腫瘤作用。

圖3. 抗CTLA-4抗體治療腫瘤的主要分子機制是通過清除腫瘤局部的Treg，而不是通過阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號通路。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）

深入研究表明，所有能有效抗腫瘤的抗CTLA-4抗體，包括強阻斷能力的L3D10和非常弱阻斷能力的Ipilimumab/HL12/HL32，都能夠有效的清除腫瘤局部的Treg【圖3F，圖3G】。而用Fc受體的阻斷抗體2.4G2同時處理小鼠來消除抗體介導的細胞殺傷作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）和抗體介導的細胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP），則能顯著逆轉Ipilimumab的抗腫瘤效果【圖3H】。因此，劉陽/鄭盼教授聯合實驗室的研究表明，抗CTLA-4抗體發揮治療腫瘤功效的主要分子機制是通過清除腫瘤局部的Treg，而不是通過阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號通路。這項研究有力地駁斥了當前流行的在癌症免疫治療中針對CTLA-4分子的免疫檢查點的理論假說。

劉陽/鄭盼教授聯合實驗室在CTLA-4領域的另一個方面的研究，集中在建立和評估抗CTLA-4抗體在免疫治療誘導的副作用（irAE，immunotherapy related adverse events）的小鼠模型。Ipilimumab作為腫瘤免疫治療的傑出代表，具有非常好的抗黑色素瘤的作用，同時也有非常強的免疫治療誘導的副作用（N Engl J Med. 2015 Jul 2;373(1):23-34.）。臨床研究表明，針對多靶點的更有效的聯合用藥是免疫治療的臨床推進方向，例如Ipilimumab和Nivolumab （抗PD-1的抗體）強強聯合後抗腫瘤效果大增。然而，一半以上的患者產生了3-4級嚴重的副作用，因此限制了抗CTLA-4抗體的研發與應用（Lancet Oncol. 2017 Jan;18(1):31-41.和N Engl J Med. 2017 Nov 9;377(19):1824-1835.）。 目前，並沒有一個非常好的臨床前模型來評估抗CTLA-4抗體的免疫治療誘導的副作用。

圖4. 利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型來模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯用造成的免疫副作用，並評估Ipilimumab和其它抗CTLA-4抗體的安全性。（摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z）

研究發現， CTLA-4人源化的新生小鼠模型【圖4A】，可以用來有效地模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯用造成的各個臟器的免疫副作用。這些副作用的表型和臨床發現的Ipilimumab單獨治療或聯合抗PD-1抗體治療後產生的副作用表型非常相似【圖4B】。比如，貧血，心肌炎，肺炎，肝炎，腎臟等多器官炎症。值得注意的是，半人源化抗體L3D10以及其完全人源化後的突變體抗體HL12和HL32在取得與Ipilimumab一樣的甚至強於Ipilimumab的抗腫瘤效果的情況下，並沒有產生嚴重的副作用【圖4C】。同樣，利用human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h ）和半人源化（CTLA4h/m）的新生小鼠模型，研究者發現，再現Ipilimumab的免疫副作用需要CTLA4雙等位基因的參與，因為在半人源化新生小鼠模型中， Ipilimumab並沒有顯示出強烈的副作用【圖4D】。

此外，研究者還發現這種免疫治療誘導的副作用，和全身的T細胞激活相關，特別是自我反應性T細胞中調節性T細胞（Treg）和效應T細胞（Teff）的比例起決定性的作用。這項研究表明，抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果和免疫治療副作用的產生並不一定是相伴相隨的，因為它們的分子機制是不一樣的（一個依賴於腫瘤局部Treg的刪除，一個依賴於自體反應性T細胞的擴增和全身T細胞的激活， 【圖5】）。

圖5. 抗CTLA-4抗體在免疫治療誘導的副作用（irAE，immunotherapy related adverse events ）和 癌症免疫治療效果（CITE，cancer immunotherapeutic effect）中有著截然不同的分子機制。 irAE是外周淋巴器官中自體反應性T細胞的多克隆擴增造成的，主要是通過抑制自身反應性T細胞轉化成自身反應性Treg細胞。 CITE引起的腫瘤排斥是通過FcR介導的特異性清除腫瘤微環境中的Treg細胞來實現的，並且此過程獨立於外周淋巴器官中天然T細胞的活化。此外，irAE和CITE都不依賴於對CTLA-4/B7相互作用的阻斷。（摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z）

劉陽/鄭盼教授聯合實驗室的一系列突破性研究成果，進一步闡明了抗CTLA-4抗體的抗腫瘤分子機制，提供了有效的評價抗CTLA-4抗體藥物安全性的小鼠模型，並初步篩選到相對於Ipilimumab更加安全的抗CTLA-4抗體克隆株HL12和HL32，這些研究對今後第3代抗CTLA-4抗體以及以CTLA-4為靶點的其它類型藥物的研發有著重要的指導意義。

據悉，本研究完成於美國國立兒童醫學中心的癌症與免疫學研究中心。杜雪相博士、唐飛博士和劉明月博士為兩篇論文的共同第一作者，劉陽教授和鄭盼教授為共同通訊作者。

參考文獻：

Keler, T. et al. Activity and safety of CTLA-4 blockade combined with vaccines in cynomolgus macaques. J. Immunol. 171, 6251–6259 (2003).

Lute K. D., et al. Human CTLA-4-knock-in mice unravel the quantitative link between tumor immunity and autoimmunity induced by anti-CTLA-4 antibodies. Blood 106, 3127–3133 (2005).

May, K. F., et al. Anti-human CTLA-4 monoclonal antibody promotes T cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model: a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies. Blood 105, 1114–1120 (2005).

Larkin, J., et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or monotherapy in untreated melanoma. N. Engl. J. Med. 373, 23–34 (2015).

Hellmann, M. D., et al. Nivolumab plus Ipilimumab as first-line treatment for advanced non-small-cell lung cancer (CheckMate 012): results of an open-label, phase 1, multicohort study. Lancet Oncol. 18, 31–41 (2017).

Weber, J., et al. Adjuvant Nivolumab versus Ipilimumab in resected stage III or IV melanoma. N. Engl. J. Med. 377, 1824–1835(2017).

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