中國倉鼠卵巢細胞系簡史

生物製藥離不開細胞表達系統，而最常用的細胞系則是中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamsters Ovary，CHO細胞）表達系統，這一細胞系又是如何從中國倉鼠中分離建立並應用於生物製藥的呢？

了解這一細胞系的歷史，對細胞學界、生物製藥業有很大啟示。

1919年，北京協和醫學院的E.T. Hsieh博士，在進行肺炎球菌感染研究時，一時找不到實驗室小鼠，便到北京郊外抓了一些中國倉鼠（Chinese hamsters）帶到實驗室做動物模型。1924年，在協和工作的Jocelyn Smyly與同事Charles Young發現中國倉鼠可以非常容易地製備寄生蟲感染模型，如黑熱病（利什曼病）等。

1928年，協和醫學院的Marshall Hertig運送了150隻中國倉鼠到哈佛醫學院，希望建成一個品系，但馴養失敗了。

1943年，Guido Pontecorvo在低倍顯微鏡下觀察中國倉鼠，他只發現了14條染色體（實際為2n=22），比起其它常用的實驗動物（小鼠的40條和大鼠的42條）要少，這使得中國倉鼠成為一個很好的研究染色體的對象。

1948年，美國北部最大的實驗動物供應商Victor Schwentker了解到中國倉鼠很有價值，卻難以在實驗室傳代（馴養），於是他囑託正在中國的美國醫生Robert Briggs Watson(1903-1978)帶幾頭來。

Watson正在參加洛克菲勒基金會研究亞洲瘧疾的醫學計劃，當時正在南京。於是Watson向協和醫學院的Cheng Hsiang-Hu胡正祥教授（1896-1968）求助，後者把20隻中國倉鼠（雌雄各半）裝在籠中，趕在北京被解放之前運至南京。

1948年12月6號，Watson帶著這20隻中國倉鼠，趕在南京解放之前來到上海，並從上海把這批中國倉鼠運至美國舊金山，然後再運至紐約，成功交給了Victor Schwentker。後來Watson又到南美等地進行醫學研究。而Schwentker於1949年初在紐約收到中國倉鼠後，經過兩年的馴養，成功地把它變成一種實驗室動物的品系。

哈佛大學的George Yerganian得到有中國倉鼠供給消息，立即應用這一動物研究染色體，他用更好的顯微鏡發現中國倉鼠有22條染色體，不是Pontecorvo報道的14條。但這也比大鼠和小鼠的染色體少得多。

Yerganian在養中國倉鼠時，創新了一套自己的飼養方法，並把方法公開，但這一動物仍然難以飼養，在相當長的時期內，Yerganian成為了美國中國倉鼠的唯一供應商。1983年，他成立Cytogen Research and Development, Inc.公司，無償為研究機構提供中國倉鼠。

1943年，Wilton Earle和NCI的同事建立了一個混雜基因小鼠的細胞系（mouse L）可以持續傳代，1948年，Earle的實驗室又建立了一個同基因的小鼠細胞系mouse L292。1951年，Johns Hopkins 大學醫學院的George Gey又建立了人的永生細胞系HeLa細胞。

1955年，Colorado 大學的Theodore Puck分離得到了單克隆的HeLa細胞系。Puck實驗室隨後開展各種各樣的哺乳動物體外培養技術研究。1957年，Puck向Yerganian訂購了中國倉鼠，後者派出一位中年婦女，把中國倉鼠放在手提籃里，乘坐2天火車送到了Puck實驗室。

Puck和同事Fa-Ten Kao通過分離中國倉鼠卵巢細胞體外培養，得到了CHO-K1細胞系，這是一上皮貼壁生長型細胞，培育方便。他們把CHO細胞免費供給需要的研究機構，使得這一細胞系成為了研究細胞生物學的基本工具之一。

1976年， 斯坦福大學的羅伯特·席姆克（Robert Schimke）和學生弗雷德·阿爾特（Fred Alt）在研究細胞對腫瘤藥物耐葯時發現了基因擴增現象，他們發現甲氨喋呤抑制細胞的二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR），而耐葯細胞則會十倍甚至百倍地表達這一基因。他們分析，這一酶基因表達抑制後可以反向調節細胞基因加速表達DHFR基因。1980年，哥倫比亞大學的勞倫斯·蔡辛（Lawrence Chasin）和蓋爾·烏爾勞布（Gail Urlaub）等發現中國倉鼠卵巢細胞-DUKX（Chinese hamster ovary cells-DUKX，CHO-DUKX）中沒有DHFR酶基因【1】。

1982年，羅伯特·席姆克的學生蘭迪·考夫曼（Randy Kaufman）來到MIT的 菲爾·夏普（Phil Sharp）實驗室讀博後。考夫曼希望在CHO細胞中表達DHFR酶基因並連接其它基因蛋白，當細胞培養基內含有甲氨喋呤（MTX）時，二氫葉酸還原酶被抑制，通過反饋調節，使得該基因自我擴增，連帶其上下游100-1000kb的基因都會擴增。這一設想被隨後的實驗證實了。不過，夏普並沒有申報專利，認為哥倫比亞大學的基因表達系統已經覆蓋了這一領域。所以夏普參加的百健公司也沒有用哺乳動物細胞表達系統生產干擾素，而是與合作夥伴先靈葆雅公司（Schering-Plough）一起採用了大腸桿菌。

但在基因泰克公司，另一位席姆克實驗室人員克里斯·西蒙森（Chris Simonsen）幫助阿瑟·萊文森實現了在CHO細胞中表達生產DHFR基因及蛋白，並於1983年1月申報了專利。而蘭迪·考夫曼因為沒有申報專利，他於1983年底到一家波士頓基因研究機構工作，在那裡他用CHO細胞表達生長激素、EPO（促紅細胞生成素）、組織活化遺傳因子tPA（組織型纖溶酶原激活劑 ）、凝血八因子等人生物蛋白。

當基因泰克公司的tPA進入臨床後，生產負責人比爾·楊（Bill Young）開始考慮大規模生產的問題，但當時哺乳動物培養都是實驗性的小規模培養，從禮來公司跳槽來到的吉姆·斯沃茨（Jim Swartz）開始把培養大腸桿菌的發酵罐應用到哺乳動物細胞中去。他們又從寶來威康（Burroughs Wellcome）公司挖來三位大規模發酵生產疫苗的工藝專家，共同組建了一支哺乳動物細胞發酵工藝研究團隊。經過幾年的努力，哺乳動物細胞發酵工藝成熟了。

1987年，基因泰克公司的tPA被FDA批准，這是第一個CHO細胞表達的上市藥品【2】。

從這時開始，CHO細胞作為哺乳動物蛋白表達系統全面走入製藥行業。CHO細胞大規模培養技術及其生物反應器工程可廣泛應用於抗體、基因重組蛋白質藥物、病毒疫苗等生物技術產品的研究開發和工業化生產。

通過幾十年的發展，CHO細胞已成為生物技術藥物最重要的表達或生產系統，成為了基因工程和生物製藥的重要工具。而相應的發酵工藝的提高，也類似晶元中的摩爾定律，在短短几十年間，已經從最初的毫克級提高到了今天的十克級。

2013年，在當年20個最暢銷的生物葯中，有11個是用CHO細胞表達的。據估計，如今用CHO細胞表達的藥品份額已經佔到數千億美元。

參考文獻：

1、Urlaub G; Chasin LA. Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 1980-07, 77 (7): 4216-4220.

2、彭雷. 極簡新葯發現史. 北京. 清華大學出版社. 2018.

本期編輯：Tony

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